Современная генетика шагнула глубоко за пределы представлений прошлого. Нынешняя наука способна формировать базы знаний на генном уровне. Генетические чипы, о которых пойдет речь в настоящей статье, способны определять признаки мутационных процессов в клетках и полиморфизм определенного гена.
1. Описание
ДНК чипы – это так называемая технология определения параметров и характеристик определенного гена, а также его свойства и эволюции.
Технология микрочипов используется в молекулярных разделах генетики и биологии. В исследованиях используются микрочипы, которые состоят из более тысячи так называемых зондов (научное название — дезоксирибонуклеотид).
ДНК зонды состоят из группы микроточек, которые закрепляются на подложке. Микроточка состоит из пико молей, образованных из цепочек нуклеотидов.
Метод гибридизации используется для определения количества и регистрации элементов молекулы гена. При этом используется флуоресцентный способ обработки данных. Этот способ определяет численность нуклеотидов заданной спирали.
2. История
Исследованиями генетической наследственности человеческого организма ученые занимаются более двух столетий. Хотя первые
ДНК чипы
результаты экспериментов и выдвигаемые теории были даны в начале двадцатого века
В 53 году двадцатого века экспериментально доказано, что в структуре белка участвуют уникальные последовательности аминокислот, которые выстроены в спиралевидную лестницу.
Разработка микрочипов была выделена из методики Саузерн-блоттинг. Эта методика состояла в том, что фрагменты генетического кадрирования переносили на твердый носитель и впоследствии с его помощью определяли последовательности нуклеотидов, которые содержатся в этом образце.
В 1987 году генетический шифр впервые был объединен в чип. В этом же году были поставлены первые эксперименты об определении экспрессий геномов в регуляции. Первые опыты проводились с помощью интерферонов молекулы.
Ранее вместо твердой поверхности использовалась фильтрованная бумага, на которую наносилось микроскопическое количество ДНК с помощью метода раскапывания.
Впервые мини-чипы использовались в 1995 году для определения экспрессии генома.
В 1997 году генетики поставили опыт, в котором безраздельный эукариотический ген находился на ДНК-чипе.
3. Принцип действия
В качестве подложки чипа используются твердые поверхности, выполненные из стекла и кремния. Существуют также миниатюрные шарики, которые используются для крепления зондов. Шарики в основном выпускает компания Illumina.
Технологии микро-кодирования отличаются следующими параметрами:
· Характеристика работы;
· Конструкция;
· Точность;
· Эффективность;
· Стоимость.
По типам ДНК зонды различаются на четыре основных вида:
· Printed – зонды изготавливаются химическим способом, после чего прилепляются к подложке. Зонд наносится иглой в определенные точки либо используется принтер (чернила обычного струйного принтера заменены на капельки нанолитрового объема).
· In-situ – способ нанесения фотолитография. Использование ультрафиолетового света для нанесения групповых нуклеотидов. Для одной группы нуклеотидов необходимо четыре раза сменить фотолитографическую маску. Первая применяется для синтезирования нуклеотидов, три оставшиеся для предотвращения защитного снятия. Один чип генетического кода составлен из ста фотолитографических масок.
· High-density – использование цветного кодирования бусинок из кварца. Бусинки распределяются случайным образом на стекле из кварца, собранного в подложку. При таком типе диагностики в одном квадратном миллиметре может быть собранно более сорока тысяч элементов.
· Bead Array – метод декодирования шариков из стекла. Каждому шарику подложки присвоен определенный адрес, который состоит из трех возможных значений последовательности.
4. Для чего необходимо
Использование технологий микроэлементов генетического кода позволяет оценить состояние и идентификацию генов живого организма. С помощью чипов возможно безраздельное и комплексное исследование биологического организма.
5. Использование в медицине и генетике
Генетика и биологическая медицина использует практические и теоретические результаты микрочипов генетического кода. Регулярно проводятся исследования для анализа экспрессии генов, благодаря чипам. При этом выявляется информация четырех направлений:
· Одно нуклеотид;
· Полиморфизм;
· Генотипирование;
· Сегментирование мутированных геномов.
Технология является эффективной при синтетическом анализе идентификации большого числа генов. При этом одновременно производиться структурный анализ, для каждого взятого нуклеотида и их последовательностях.
6. Перспективы развития
Распространенное использование этой технологии в генетики и молекулярной биологии связано с несколькими параметрами, которыми обладают современные чипы:
· Очень высокая чувствительность;
· Специфичность технологии;
· Воспроизводство экспериментальных результатов;
· Простота реализации процедур;
· Возможная реализация одновременной информации с большого количества параметров;
· Невысокая стоимость затрат.
7. Познавательные факты
В настоящее время существуют два метода традиционной диагностики, обладающие следующими характеристиками:
· Реальное время:
· Оценка численности матрицы в основании;
· Нет, труднодостижимых работ;
· Нет, этапа электрофореза, малый риск ложных результатов;
· Полученные результаты анализируются математически;
· Минимальные требования к организации лаборатории;
· Существенная экономия времени.
· Биологические чипы:
· Миниатюрные образцы;
· Маленькие затраты на работу;
· Экономия времени;
· Серийный анализ характеристик;
· Чувствительность метода;
· Простота выполнения.
Вероятно, объединив два метода диагностики можно сформировать абсолютно уникальный вид технологического анализа, который эффективно справиться со всеми задачами будущего и современности.
В последнее время активно развиваются ДНК-технологии, которые позволяют не только определять признак, но и одновременно проводить дифференциальный сиквенс, т.е. определение точечных мутаций или полиморфизма в известных участках генома. Данные технологии имеют значительные преимущества перед традиционными молекулярно-биологическими методами, т.к. они позволяют миниатюризировать исследуемый образец и анализатор, что значительно снижает стоимость анализа и время его проведения, а также одновременно определять различные параметры исследуемого образца, причем без потери чувствительности амплификационных методов. Главным преимуществом методов основанных на использовании чипов с олигонуклеотидами всех возможных нуклеотидных последовательностей данной длины, является их универсальность. Наличие на чипе олигонуклеотида любой последовательности делает возможным анализ любой исследуемой последовательности. В основе применения микрочипов лежит принцип быстрого определения взаимодействий тех или иных лигандов со множеством различных зондов одновременно. Собственно биологические микрочипы представляют собой ту или иную твердую подложку, на которой нанесены или определенные фрагменты нуклеиновых кислот, или белки, или углеводы, или какие-либо иные молекулы-зонды, способные быть узнанными или проявлять биологическую активность. Количество различных зондов на подложке может достигать сотен тысяч, причем чипы каждого типа строго идентичны и при существующих технологиях могут быть реплицированы в сотнях тысяч и миллионах копий нанесенных на подложку.
ДНК-микрочипы
Существуют белковые, ДНК, углеводные, тканеые чипы. Особого внимания заслуживают ДНК-чипы. Они представляют собой уникальный аналитический инструмент, позволяющий определять наличие в анализируемом образце (как правило, биологического происхождения) заданных последовательностей ДНК (т.н. гибридизационный анализ). Проведение анализа с помощью ДНК–чипов обходится в несколько раз дешевле, чем при использовании альтернативных технологий (электрофорез, ПЦР в реальном времени) и допускает, при наличии детектора несложной конструкции, работу вне лаборатории.
Впервые ДНК–чипы были использованы в исследованиях в конце 80-х годов прошлого века. В основе этого теперь уже широко распространенного метода, позволяющего одновременно анализировать экспрессию множества генов, лежит принцип узнавания мРНК-овых или кДНК-овых мишеней посредством их гибридизации с иммобилизованными на микрочипе одноцепочечными фрагментами ДНК.
ДНК–чип – это твердая подложка, на которой иммобилизованы (как правило, ковалентно) однонитевые фрагменты ДНК разной длины: короткие – 15-25 нуклеотидов, длинные – 25-60 нуклеотидов и кДНК фрагменты – от 100 до 3000 нуклеотидов. В качестве материала подложки используют стекло, кремний, различные полимеры, гидрогели (например, на основе полиакриламида) и даже золото.
Гибридизация-основа технологии
Основа всех современных ДНК-технологий – гибридизация. В результате гибридизации молекулы нуклеиновых кислот способны формировать устойчивые двухцепочечные структуры благодаря связям между элементами молекул - нуклеотидами. Нуклеотид аденин (А) комплиментарен тимину (Т), гуанин (Г) - цитозину (Ц). В результате одноцепочечная последовательность нуклеотидов АТГЦ будет образовывать стабильную ассоциацию, двухцепочечную структуру, с одноцепочечной молекулой ДНК состава ТАЦГ.
….. АТГЦ….
| | | |
….. ТАЦГ….
Подобная комплементарность приводит к «слипанию» двух молекул ДНК, одна из которых может быть неподвижно закреплена на подложке, и являться элементом ДНК-чипа. Чем больше содержится в образце молекул комплиментарных элементам чипа, тем больше их будет связываться с чипом, и тем выше будет интенсивность сигнала, воспринимаемого от данного элемента. На рис. 1 показан принцип действия ячейки ДНК или олигонуклеотидного биочипа, основанный на комплементарных взаимодействиях основания аденина (А ) с тимином (Т ) и гуанина (G ) с цитозином (С ) в двух нитях ДНК. Если последовательность оснований в одной нити ДНК (или олигонуклеотида) полностью комплементарна последовательности другой нити, то образуется стабильная совершенная двухнитчатая спираль - дуплекс. Однако присутствие в дуплексе даже одной неправильной пары, например G-G , предотвращает образование дуплекса. Если иммобилизовать в одном из элементов микрочипа специфическую одноцепочечную ДНК или, положим, 20-мерный олигонуклеотид (пробу), то при добавлении к микрочипу меченных флюоресцентными красителями фрагментов ДНК, например генома человека, будет происходить их высокоспецифичное взаимодействие. Заданный олигонуклеотидный элемент биочипа специфически свяжет только одну комплементарную последовательность из 4 20 =1.09х10 12 всех возможных последовательностей этой длины в ДНК. В результате флюоресцентное свечение наблюдается только на этом комплементарном элементе биочипа. Таким образом, один элемент биочипа производит одну выборку примерно из триллиона возможных вариантов, в отличие от элемента электронного чипа, где происходит двоичная выборка: ДА или НЕТ .
Рис. 1. Схема образования двойной спирали ДНК на биочипе. Олигонуклеотид фиксирован на одном из элементов биочипа и избирательно связывает из многих флуоресцентно меченых фрагментов ДНК только комплементарный. В результате только этот элемент начинает светиться. Это происходит благодаря высоко-специфичным взаимодействиям комплементарных пар нуклеотидов А с Т и G с С. Присутствие некомплементарной пары, например G-G , предотвращает взаимодействие и оставляет элемент микрочипа темным.
Используемые для определения параметров гибридизации устройства позволяют регистрировать не только конечный результат, но и кинетику ассоциации и диссоциации комплементарных цепей. Эти технологии, делая возможным многопараметрический анализ образцов, могут предоставлять большое количество информации. Результаты гибридизации зависят от длины ДНК - пробы, химического состава меченой ДНК - мишени, температуры, при которой проводится гибридизация, состава гибридизационной смеси, типа флуоресцентной метки. Здесь необходимо отметить, что в ДНК-чипах в основном используется пассивная гибридизация, т.е. взаимодействие ДНК-мишени с иммобилизованной пробой является вероятностным процессом и зависит от различных условий.
Применение ДНК-чипов
Оценка состояния и идентификация всех генов исследуемого организма является одной из важнейших задач, поставленных перед разработчиками ДНК-чипов. Решение этой задачи может быть реализовано в иммобилизации всех генов организма на биологический чип, что позволит комплексно оценить состояние генов и генома в целом. Биогенетические базы данных, содержащие всю информацию (систематизированную) по генам и геномам различных организмов, представляют исследователям огромные возможности в дизайне ДНК-чипов.
К основным причинам широкого распространения биочиповых исследовианий относят высокую чувствительность, специфичность и воспроизводимость, простоту процедуры выполнения, возможность одновременного анализа множества параметров и относительно невысокую стоимость работ. Эти же причины заставляют рассматривать биочипы как перспективный инструмент в различных областях народного хозяйства.
Подводя некоторые итоги нужно отметить, что микрочипы являются эффективным подходом для одновременной идентификации от десятков до тысяч генов и их структурного анализа, для выявления специфичных нуклеотидных последовательностей и нуклеотидных вариаций в их структуре. Однако, когда гены присутствуют в геноме в количестве одной или нескольких копий, с чем постоянно и приходится сталкиваться в клинической практике, требуется их предварительная амплификация. Наиболее эффективным методом амплификации ДНК является полимеразная цепная реакция, в процессе которой происходит экспоненциальное увеличение количества молекул ДНК от нескольких до миллионов и более копий, а основное достоинство такого вида ПЦР как Real Time, позволяют давать даже количественную оценку исследуемой матрицы. Это имеет важное значение для решения задач в области развития фундаментальных и интегральных наук, а так же оптимизации условий методов диагностики.
Итак, два метода, ставшие уже традиционными для некоторых областей науки и прикладных технологий, на ряду со своими недостатками имеют совершенно уникальные достоинства.
RealTime ПЦР:
· дает возможность оценивать количество исходной матрицы;
· не требует дополнительных трудоемких этапов работы;
· отсутствие стадии электрофореза позволяет минимизировать риск контаминации и таким образом уменьшить число ложноположительных результатов;
· использование математических методов анализа позволяет проводить автоматическую интерпретацию полученных результатов и снимает проблему субъективной оценки электрофореграмм;
· обеспечивает менее строгие требования к организации ПЦР-лаборатории и автоматической регистрации и интерпретации результатов;
· позволяет экономить время.
Биологические микрочипы:
· позволяют миниатюризировать образец и анализатор;
· экономит время и стоимость анализа;
· позволяет одновременно определять несколько параметров исследуемого образца;
· убладает высокой чувствительностью амплификационных методов, специфичностью и воспроизводимостью;
· обеспечивает простоту процедуры выполнения работы.
Возможно, что объединие этих методов за счет перевода полимеразной цепной реакции в формат микрочипов позволит создать диагностическую систему нового поколения, которую будут характеризовать следующие качества: более высокая чувствительность и, главным образом, специфичность определения нуклеиновых кислот, высокая производительность при низкой себестоимости выполнения анализа, общее сокращение количества манипуляций в пределах каждого этапа анализа.
) — миниатюрная пластина с нанесенными на нее в определенном порядке фрагментами известной последовательности для проведения генетического анализа.
Описание
ДНК-микрочип - устройство, созданное по аналогии с электронными микросхемами (чипами), предназначенное для одновременного выявления множества определенных последовательностей ДНК. ДНК-микрочип используется для изучения экспрессии генов и поиска мутаций в биомедицинских исследованиях. Микрочип изготавливается из стекла, силикона или пластика. ДНК наносится на него методом машинной микропечати и химической пришивки в виде множества упорядоченных точек, каждая из которых содержит равное количество синтезированных ДНК-фрагментов, имеющих уникальную последовательность. В других технологиях гибридизационного анализа генов комплементарные фрагменты ДНК пришивают к микроскопических шариков. Современные ДНК-микрочипы могут одновременно измерить экспрессию десятков тысяч генов у человека и выявить около миллиона мутаций. Принцип работы микрочипа для изучения экспрессии генов состоит в следующем. Активная работа гена в данной ткани выражается в накоплении его матричной (мРНК). Все мРНК экстрагируются из образца ткани, и с помощью фермента обратной транскриптазы на них синтезируется так называемая комплементарная ДНК (кДНК), которая значительно устойчивей и удобней в работе, чем мРНК. Полученный набор кДНК метят с помощью флуоресцентных или радиоизотопных меток.
Содержание индивидуальных кДНК в образце прямо пропорционально содержанию их мРНК-матриц и, следовательно, уровню активности соответствующих генов. Смесь кДНК наносят на микрочип, в каждой точке которого пришиты ДНК-фрагменты, соответствующие кодирующей последовательности одного из генов. кДНК находят «свои» точки и связываются (гибридизуются) с ними по принципу комплементарности. Чем больше в растворе кДНК данного вида, тем больше ее прикрепляется к своей точке. Затем специальное сканирующее устройство определяет содержание кДНК в каждой точке микрочипа, а программа соотносит его с названием гена, представленного данной точкой. Результатом ДНК-микрочипового исследования является матрица из точек, интенсивность которых прямо пропорциональна активности соответствующих генов.
Иллюстрации
Авторы
- Народицкий Борис Савельевич
- Ширинский Владимир Павлович
- Нестеренко Людмила Николаевна
Источники
- DNA Chip Technology / Office of Science Education and Outreach: Research Technique Fact Sheets URL: http://www.genome.gov/DIR/VIP/Learning_Tools/Fact_Sheets/dna_chip.html (дата обращения 12.10.2009)
- Ke Y., Stuart L., Yung C., Yan L., Hao Y. Self-assembled water-soluble nucleic acid probe tiles for label-free RNA hybridization assays.// Science – № 5860 (319), 2008 – P.180-183
Специфической последовательности. Олигонуклеотид может являться коротким участком гена или другого компонента ДНК, и используется для гибридизации с кДНК или мРНК. Гибридизация зонда и мишени регистрируется и количественно определяется при помощи флюоресценции или хемолюминесценции, что позволяет определять относительное количество нуклеиновой кислоты с заданной последовательностью в образце.
В обычном ДНК микрочипе зонды ковалентно прикрепляются к твердой поверхности - стеклянному или кремниевому чипу. Другие платформы, например, выпускаемые Illumina , используют микроскопические шарики вместо больших твердых поверхностей. ДНК микрочипы отличаются от других микрочипов только тем, что их применяют для измерения ДНК или как часть более сложной системы детекции и анализа ДНК.
ДНК микрочипы используют для анализа изменения экспрессии генов , выявления однонуклеотидных полиморфизмов , генотипирования или повторного секвенирования мутантных геномов . Микрочипы отличаются по конструкции, особенностям работы, точности, эффективности и стоимости.
История
Примечания
Wikimedia Foundation . 2010 .
Смотреть что такое "ДНК-микрочип" в других словарях:
Термин ДНК микрочип Термин на английском DNA microarray Синонимы ДНК чип, DNA chip, Gene сhip, DNA chip Аббревиатуры Связанные термины биосенсор, геном, ДНК, ДНК зонд, лаборатория на чипе, РНК, олигонуклеотид Определение Миниатюрная пластина с… …
Термин ДНК зонд Термин на английском DNA probe Синонимы Аббревиатуры Связанные термины биологические нанообъекты, биомедицинские микроэлектромеханические системы, биосенсор, геном, ДНК, ДНК микрочип, лаборатория на чипе, олигонуклеотид… … Энциклопедический словарь нанотехнологий
Термин ДНК Термин на английском DNA Синонимы дезоксирибонуклеиновая кислота Аббревиатуры ДНК Связанные термины доставка генов, актуатор, бактериофаг, белки, биологические нанообъекты, биомиметика, биомиметические наноматериалы, генная инженерия,… … Энциклопедический словарь нанотехнологий
ДНК-чип
ДНК-биочип - DNA Chip ДНК чип (также: ДНК биочип, ДНК микрочип, ДНК наночип) Специальный чип, используемый для выявления генетических мутаций или сдвигов, диагностики заболеваний. Биочип для американской армии, разработанный специалистами из… … Толковый англо-русский словарь по нанотехнологии. - М.
Микрочип генный м микроматрица - Микрочип, генный м., микроматрица * мікрачып, генны м., мікраматрыца * microarray or gene chip or microchip набор из тысяч уникальных известных однонитевых фрагментов ДНК, иммобилизированных на твердую основу. Эти фрагменты представляют все… … Генетика. Энциклопедический словарь
Сэр Эдвин Мэллор Саузерн (р. 7 июня 1938) английский молекулярный биолог, член лондонского королевского общества по развитию знаний о природе (также известного как лондонское королевское общество), лауреат премии Ласкера (2005). Премия была … Википедия
ДНК микрочип, содержащий комплементарные ДНК. Комплементарная ДНК (кДНК, англ. сDNA) это ДНК, синтезированная из зрелой мРНК в реакции, катализируемой обратной транскриптазой. кДНК ча … Википедия
Количественный анализ нуклеиновых кислот определение концентрации ДНК или РНК в смеси или чистом препарате. Реакции с участием нуклеиновых кислот часто требуют точных сведений о количестве и чистоте препарата. Для определения концентрации… … Википедия
Термин амплификация Термин на английском amplification Синонимы Аббревиатуры Связанные термины Определение (лат. amplificatio усиление, увеличение), в молекулярной биологии увеличение числа копий ДНК. Описание В клетке амплификация происходит в… … Энциклопедический словарь нанотехнологий
Позволяют анализировать огромное число генетических особенностей в одном образце исходного материала. При этом желательно, чтобы ДНК-чипы обладали двумя свойствами, которые в некотором смысле противоречат друг другу. С одной стороны, интересно в одном ДНК-чипе иметь как можно больше ячеек, чтобы получить больше информации об изучаемом образце. В то же время, исследователи зачастую вынуждены работать с очень малыми объемами биологического материала, поэтому чем меньше размер ДНК-чипа, тем лучше.
Современные методы (например, атомно-силовая микроскопия, AFM) позволяют детектировать сигнал в ячейках ДНК-чипа, когда их размеры составляют несколько десятков нанометров. Методы производства таких ДНК-чипов основаны на литографии (наиболее привлекателен метод dip-pen нанолитографии, DPN). Создание чипов со столь маленькими ячейками обычно весьма дорого и занимает много времени.
Группа ученых из США и Кореи предложила способ более дешевого, быстрого и массового производства ДНК-микро- и наночипов. Исследователи показали, что, взяв один ДНК-чип в качестве образца, можно за один шаг отпечатать чип, комплементарный исходному. Такой способ получения ДНК-чипов назван методом супрамолекулярной нанопечати (supramolecular nanostamping, SuNS) и схематически представлен на рисунке 1.
В качестве образца ученые взяли массив из одноцепочечных ДНК, пришитых к наночастицам золота, в котором размер ячейки составлял 9±2 нм, а расстояние между ячейками 77±9 нм. К этому ДНК-чипу добавили комплементарную ДНК, модифицированную гексилтиолом на 5’-конце. После гибридизации (то есть связывания комплементарных цепей ДНК) на чип-образец поместили стеклянную подложку, покрытую золотом. Комплементарные цепи ДНК присоедились к этой новой подложке. Затем при 90 °С была осуществлена дегибридизация, и в итоге получен отпечаток, комплементарный исходному образцу.
Исследовав полученную копию, ученые пришли к выводу, что отпечаток сделан успешно: на новом ДНК-чипе имелись ячейки размером 14±2 нм, разделенные 77±10 нм промежутками (рисунок 2). Чтобы показать, что расположение ячеек в массиве одинаково для образца и отпечатка, была рассчитана функция радиального распределения для обоих случаев (рисунок 3). Видно, что функции получились довольно похожи.
В дальнейшем необходимо показать, что SuNS пригодна для печати многокомпонентных чипов и для производства многих копий с одного образца без потери точности. Исследователи верят, что смогут продемонстрировать это в ближайшем будущем.
Работа «Application of supramolecular nanostamping to the replication of DNA nanoarrays» напечатана в журнале Nano Letters .
Загрузка...
