6. Цитокиновая сеть. Классификация и функция цитокинов.
Цитокины - группа растворимых клеточных пептидных медиаторов, продуцирующихся разными клетками организма и играющих важную роль в обеспечении физиологических процессов в норме и при патологии.
Свойства цитокинов:
полипептиды средней ММ (< 30 кД)
регулируют силу и продолжительность реакций иммунитета и воспаления
секретируются локально
действуют как паракринные и аутокринные факторы
свойство избыточности (одни и те же цитокины вырабатываются разными клетками)
взаимодействуют с высокоаффинными рецепторами к цитокинам на мембранах клеток
плейотропность (одни и теже цитокины действуют на различные клетки-мишени)
каскадность («цитокиновая сеть»)
синергизм, антагонизм
Классификация цитокинов:
Интерлейкины (ИЛ1-ИЛ18) – секреторные регуляторные белки иммунной системы, обеспечивающие медиаторные взаимодействия в иммунной системе и связь ее с другими системами организма.
Интерфероны (ИФНα,β,γ) – противовирусные агенты с выраженным иммунорегуляторным действием.
Факторы некроза опухолей (ФНОα,ФНОβ) – цитокины с цитотоксическим и регуляторным действием.
Факторы роста (ФРФ, ФРЭ, ТФР β) – регуляторы роста, дифференцировки и функциональной активности клеток.
Колониестимулирующие факторы (ГМ-КСФ, Г-КСФ, М-КСФ) – стимуляторы роста и дифференцировки гемопоэтических клеток.
Хемокины (RANTES, MCP-1, MIP-1a) – хемоаттрактанты для лейкоцитов.
Классификация цитокинов по биологической активности:
Цитокины – регуляторы воспалительных реакций:
провоспалительные цитокины (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНОα, ИФНγ, МИФ)
противовоспалительные (ТРФβ, ИЛ-10, ИЛ-4, ИЛ-13).
Цитокины – регуляторы клеточного антигенспецифического иммунного ответа (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-10, ИФНγ, ТРФβ).
Цитокины – регуляторы гуморального антигенспецифического иммунного ответа(ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-13, ИФНγ, ТРФβ).
7. Эндоцитозные, сигнальные и растворимые рецепторы врожденного иммунитета.
Особую роль в реакциях врожденного иммунитета играют паттернраспознающие рецепторы (PRR, особенно Toll-подобные рецепторы - TLR), распознающие компоненты микроорганизмов и эндогенные сигналы опасности, которые возникают в организме. В результате действия высокоэффективных механизмов врожденная иммунная система определяет потенциальные патогены, распознавая ЛПС, пептидогликаны, липопептиды, флагеллин и многие другие консервативные и неизменяющиеся структурные молекулы.
В этом отношении врожденную иммунную систему рассматривают как первую линию защиты против патогенных микроорганизмов у млекопитающих. Одна из целей врожденного иммунитета сводится к раннему установлению различий между патогенами и непатогенами, что особенно важно в пограничных тканях (слизистые оболочки пищеварительного тракта и дыхательных путей, кожа и т.д
Рецепторы опознавания паттерна классифицируют по специфичности к лиганду, функции, локализации и по происхождению в эволюции. По функции они делятся на два класса: сигнальные и эндоцитозные.
Сигнальные рецепторы опознавания паттерна включают, например, толл-подобные рецепторы.
Эндоцитозные рецепторы опознавания паттерна , например, маннозные рецепторы макрофагов, необходимы для прикрепления, поглощения и процессирования микроорганизмов фагоцитами независимо от внутриклеточной передачи регуляторного сигнала. Кроме патогенов они опознают также апоптозные клетки.
Мембранные рецепторы опознавания паттерна
Рецепторы-киназы
Впервые рецепторы опознавания паттерна были открыты у растений . Позже множество гомологичных рецепторов было обнаружено при анализе геномов растений (у риса 370, у Arabidopsis - 47). В отличие от рецепторов опознавания паттерна у животных, которые связывают внутриклеточные протеинкиназы с помощью адапторных белков, растительные рецепторы представляют собой один белок, состоящий из нескольких доменов, внеклеточного, опознающего патоген, внутриклеточного, обладающего киназной активностью, и трансмембранного, связывающего первые два.
Толл-подобные рецепторы
Этот класс рецепторов опознает патогены вне клеток или в эндосомах . Они были впервые обнаружены у дрозофилы и индуцируют синтез и секрецию цитокинов, необходимых для активации иммунного ответа. В настоящее время толл-подобные рецепторы обнаружены у многих видов. У животных их насчитывают 11 (TLR1-TLR11). Взаимодействие толл-подобных рецепторов с лигандами приводит к индукции сигнальных путей NF-kB и МАР-киназы, которые, в свою очередь, индуцируют синтез и секрецию цитокинов и молекул, стимулирующих презентацию антигена .
Цитоплазматические рецепторы опознавания паттерна
Nod-подобные рецепторы
Nod-подобные рецепторы - это цитоплазматические белки с различными функциями. У млекопитающих их найдено около 20, и большинство из них подразделяют на два главных подсемейства: NOD и NALP. Кроме того, к этому семейству рецепторов относят трансактиватор главного комплекса гистосовместимости класса II и некоторые другие молекулы. Опознавая патоген внутри клетки, рецепторы олигомеризуются и образуют инфламмасому, активирующую ферменты протеолитической активации цитокинов, например, интерлейкина 1 бета. Рецепторы активируют также сигнальный путь NF-kB и синтез цитокинов .
Известны два главных представителя: NOD1 и NOD2. Связывают два разных бактериальных пептидогликана .
Известно 14 белков (NALP1 - NALP14), которые активируются бактериальными пептидогликанами, ДНК, двухцепочечной РНК, парамиксовирусом и мочевой кислотой. Мутации некоторых из NALPS являются причиной наследственных аутоиммунных заболеваний.
Другие Nod-подобные рецепторы
Такие молекулы, как IPAF и NAIP5/Birc1e также индуцируют протеолитическую активацию цитокинов в ответ на появление сальмонеллы и легионеллы.
РНК хеликазы
Индуцируют антивирусный иммунный ответ после активации вирусной РНК. У млекопитающих это три молекулы: RIG-I, MDA5 и LGP2.
Секретируемые рецепторы опознавания паттерна
Многие рецепторы опознавания паттерна, например, рецепторы комплемента, коллектины и пентраксины, к которым, в частности, относится C-реактивный белок, не остаются в синтезирующей их клетке и попадают в сыворотку крови . Одним из важнейших коллектинов является лектин, связывающий маннозу; он опознает широкий спектр патогенов, в состав клеточной стенки которых входит манноза, и индуцирует лектиновый путь активации системы комплемента .
Уже упоминавшиеся Toll-рецепторы были открыты в совершенно ином, не иммунологическом контексте, в конце 1980-х годов.
Первый белок этого семейства был охарактеризован в лаборатории К. Нюсляйн-Фольхард (С. Ntisslcin-Volhard) в ходе скрининга мутаций в генах, участвующих в регуляции дорзовентрального компонента эмбриогенеза (10). Было обнаружено несколько генов, продукты которых принадлежали к одному и тому же сигнальному пути, причем одна из мутаций приводила к тому, что у личинок дрозофилы не было выраженной брюшной или задней стороны, весь эмбрион состоял как бы только из спины. Этот мутант и получил название “Toll”, что по-немецки означает «удивительно, необыкновенно», - именно из-за необычности фенотипа. По традиции генетиков, такое же название получил и ген. Интересно, что за комплекс работ, открывших большинство генетических путей, участвующих в раннем эмбриональном развитии дрозофилы (в том числе и за Toll), была присуждена Нобелевская премия 1995 г. — буквально накануне открытия роли этого гена во врожденном иммунитете. Возможно, Toll — самый «нобелевский» ген в истории науки.
Итак, ген Toll кодирует белок, состоящий из трех доменов, один из которых является трансмембранным. Внеклеточный домен содержит около 30 повторов с фиксированным расстоянием между консервативными лейцинами, их называют лейцин-богатыми участками или повторами (leucine-rich regions, LRR), и они встречаются во многих белках, связанных с иммунным ответом у разных организмов. Функция внутриклеточного домена первоначально была непонятна, но постепенно выяснилось, что она передаст сигнал на активацию транскрипционных факторов, которые являются мушиными родственниками NFkB. И у человека, и у мыши NFkB — это семейство чрезвычайно важных транскрипционных факторов, которые участвуют в индукции многих генов, вовлеченных в воспалительный и иммунный ответ. Как уже упоминалось, основным компонентом защитного ответа у мух является индукция антимикробных пептидов, которые, связываясь с клеточными стенками бактерий или грибков, убивают их. Когда в начале 1990-х годов были клонированы гены, кодирующие эти антимикробные пептиды, то выяснилось, что в их промоторах есть ДНК-последовательности, соответствующие NFKB-связывающим участкам. Это указывало на то, что гены, которые индуцируются в ходе защитного иммунного ответа по Toll-сигнальному пути, транскрипционно регулируются NFkB. Оставалось проверить, будут ли производиться эти защитные пептиды у мух, мутантных по Toll (исходная Toll-мутация не подходила, так как была летальной!), и что будет, если их инфицировать бактериями или грибками. Как отмечалось во введении, именно этот «нобелевский» эксперимент и был поставлен в лаборатории Ж. Хоффмана в Страсбурге Б. Лёметром. Оказалось, что мутантные мухи быстро умирали в ответ на грибковые инфекции именно из-за того, что антигрибковые пептиды, которые в норме быстро индуцируются в ответ на инфекцию, у них не синтезировались. Интересно, что ответ на некоторые бактериальные патогены у таких мух был совершенно нормальным, что свидетельствовало в пользу того, что мутация нарушила только одну из ветвей врожденного иммунного ответа.
Как уже отмечалось, спустя короткое время рецепторы, похожие на Toll, были проклонированы и у млекопитающих — у человека и мыши. Они получили название TLR — Toll-like receptors (или Toll — подобные рецепторы). Позднее выяснилось, что таких рецепторов у млекопитающих 10-12, причем количество функциональных рецепторов различается у разных видов, что указывает на недавние эволюционные изменения.
TLR мыши и человека также индуцируют сигнальный путь, приводящий к активации NFkB, что запускает экспрессию всевозможных эффекторных генов, включая гены воспалительных цитокинов и так называемых ко-стимуляторных молекул.
Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .
2.2. Распознавание чужого в системе врожденного иммунитета
in vivo на нокаутных животных по генам TLR (по исчезновению способности обеспечивать защиту от тех или иных патогенов). Связывающие участки TLR обладают достаточно высоким сродством к лигандам. Эти участки представляют собой подковообразные структуры, наружная часть которых образована а-спиралями, а внутренняя - связывающая лиганд - р-слоя- ми. Данные о специфичности и локализации TLR человека схематически отражены на рис. 2.11.
Чаще всего TLR распознают липидсодержащие структуры, олигонуклеотиды и углеводы; реже всего - белки (например, флагеллин в случае TLR-5). Достаточно сложно происходит образование комплекса при распознавании бактериального ЛПС рецептором TLR-4 (см. рис. 2.10). Для распознавания ЛПС прежде всего требуется его высвобождение из клеточной стенки бактерии, после чего он образует комплекс с сывороточным фактором LBP (LPS-binding complex - ЛПС-связывающий комплекс). LBP обладает сродством к мембранной молекуле CD14, что обеспечивает взаимодействие с ней комплекса ЛПС-LBP. Затем этот комплекс (уже прикрепленный к мембране через липид А, входящий в состав ЛПС) связывается с внутренней (гидрофобной) поверхностью молекулы MD2, своей наружной поверхностью взаимодействующей с внутренней поверхностью «подковы» TLR-4 (т.е. фактически TLR-4 распознает не ЛПС, а MD2). Сходная роль корецепторных молекул выявлена при распознавании паттернов TLR-2; в этом случае в качестве корецепторов выступают молекулы CD14, CD36 и интегрин avP3 (витронектин). По-видимому, для распознавания паттернов TLR необходимо участие дополнительных молекул.
Некоторые TLR распознают нуклеиновые кислоты и структуры, сходные с нуклеотидами, что важно для распознавания как вирусов, так и бактерий. Так, TLR-3 распознает двуспиральную РНК, характерную для большинства вирусов, а TLR-9 - участки ДНК, обогащенные неметилированными последовательностями CpG (Cytidine-Phosphate-Guanosine - цитидин-фос- фат гуанозин), характерными для ДНК бактерий. TLR-7 и TLR-8 обладают сродством к имидазохолиновым и гуанозиновым производным (например, при взаимодействии с ними TLR-7 мобилизуется противовирусная защита). Учитывая структурное родство этих производных с вирусной ДНК, считают, что TLR-7 и TLR-8 участвуют в распознавании односпиральной вирусной РНК. Все 4 типа TLR, распознающих нуклеиновые кислоты (TLR-3, TLR-7, TLR-8, TLR-9), локализованы внутри клетки (см. рис. 2.11). В связи с особенностями структуры трансмембранного участка этих TLR они представлены только на мембране эндоплазматического ретикулума, но не на плазмолемме. При эндоцитозе материала, содержащего PAMP, происходит мобилизация TLR из мембраны ретикулума в мембрану фаголизосомы, где они распознают паттерны и передают сигнал внутрь клетки. Локализация TLR-3, TLR-7, TLR-8, TLR-9 не на поверхности клетки, а в фаголизосоме предохраняет от распознавания собственных нуклеиновых кислот, что чревато развитием аутоиммунной патологии. Собственные ДНК или РНК попадают в фаголизосомы только при усиленном апоптозе. Кроме того, нуклеиновые кислоты, расположенные внутри вирусов и бактерий, становятся доступными для рецепторов только в фаголизосомах, где происходит разрушение патогенов. Экспрессия TLR на клетках врожденного иммунитета описана в табл. 2.10.
В результате распознавания лигандов TLR генерируется активационный сигнал. Решающую роль при этом играет внутриклеточный TIR-домен, а также связанные с ним адапторные молекулы. Процесс передачи сигнала от TLR будет рассмотрен в контексте активации клеток врожденного иммунитета (см. раздел 2.2.4).
Таблица 2.10. Экспрессия Толл-подобных рецепторов на клетках иммунной системы
Рецептор |
Типы клеток |
Влияние активации на экспрессию |
||||||||
Моноциты и макрофаги |
Нейтрофилы |
-0 К Я ¦8- о Я я со О 0 |
Тучные клетки |
Дендритные клетки |
Естественные киллеры |
я я н ф к « 1 CQ |
я я н ф к « |
Естественные регуляторные Т-клетки |
||
TLR-1 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ (М, П) |
+ |
+ |
+ |
+ |
Конститутивная экспрессия на всех клетках |
TLR-2 |
++ |
++ |
|
+ |
++(М) |
|
|
|
+ |
|
TLR-3 |
++/+* |
- |
- |
- |
++(М) |
++ |
- |
+ |
- |
Нет усиления |
TLR-4 |
++ |
++ |
+ |
+ |
++(М) |
+ |
|
|
+ |
Усиление под влиянием патогенассоцииро- ванных молекулярных паттернов и цитокинов |
TLR-5 |
++ |
+ |
- |
- |
+ (М) |
+ |
+ |
- |
+ |
Нет усиления |
TLR-6 |
++ |
+ |
- |
+ |
+(М, П) |
+ |
+ |
++ |
+ |
То же |
TLR-7 |
+ |
+ |
+ |
- |
+ (П) |
- |
- |
+ |
+ |
Усиление под влиянием цитокинов |
TLR-8 |
++ |
+ |
- |
- |
+ (М) |
+ |
+ |
- |
+ |
Усиление под влиянием IFNy |
TLR-9 |
+ |
+ |
+ |
- |
+ (П) |
+ |
- |
+ |
- |
То же |
TLR-10 |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
- |
- |
+ |
- |
Нет усиления |
М - миелоидные;
П - плазмоцитоидные;
* - сильная экспрессия на моноцитах, более слабая на макрофагах.
Секретируемые PRRs - это белки жидких сред организма. Для «хвостов» этих молекул есть специальные рецепторы на мембранах фагоцитов, что обеспечивает передачу информации из раствора в клетки врожденного иммунитета. Сериновые протеазы 1 и 2, ассоциированные с маннансвязывающим лектином (Maspl и Masp2), подобно протеазам классического пути активации комплемента С1r и C1s. Однако, протеазы маннансвязывающего пектина активируются при связывании с микробным лигандом.
Эндоцитозные PRRs локализуются на поверхности фагоцитов. После распознавания PAMPs микробов PRRs опосредуют поглощение патогена и его доставку к лизосомам для расщепления. Процессированные пептиды представляются молекулами МНС на поверхности макрофага Т-лимфоцитам. К эндоцитозным PRRs принадлежит маннозный рецептор макрофага, распознающий терминальную маннозу и остатки фукозы на клеточных стенках микробов, и опосредует их фагоцитоз. Другой эндоцитозный PRR - макрофагальный рецептор-мусорщик, распознающий полианионные лиганды (двунитчатые ДНК, ЛПС, липотейхоевые кислоты), при связывании с бактериальной стенкой способствует клиренсу бактерий из кровообращения. PRRs усиливают фагоцитарные функции эффекторов врожденного иммунитета и обеспечивают удаление всех разрушенных фрагментов клеток.
Сигнальные PRRs распознают PAMPs и активируют пути передачи сигнала для экспрессии разнообразных генов иммунного ответа, включая провоспалительные цитокины Данный класс рецепторов включает эволюционно законсервированные, так называемые Toll-подобные рецепторы (TLR), «звонящие» на мембране клетки, «оповещающие о приходе чужого».
Toll-подобные рецепторы (TLR) . Первый рецептор Toll-семейства, реагирующий с паттернами микроорганизмов, был идентифицирован у дрозофил. У них обнаружен ген, ответственный за формирование дорсо-вентральной полярности в эмбриогенезе, а также, обеспечивающий врожденный иммунитет против грибков.
Цитоплазматические домены рецептора IL-1 млекопитающих и Toll у дрозофил, названные TIR доменом (Toll/IL-1 гомологичный домен), обладают гомологичным строением и индуцируют пути передачи сигнала, активирующего транскрипцию ядерных факторов-кВ (NF-kB).
Несмотря на то что различные TLR- и NOD-рецепторы имеют специфические лиганды, пострецепторные сигнальные пути, приводящие к активации NFkB, одинаковы. Сигнальный каскад начинается с привлечения молекул адаптерных белков MyD88, IRAK и TRAF6, что ведет к активации IкК, который, в свою очередь, фосфорилирует IкВа, нацеливая его на убиквитинацию и распад под действием 26S протеасомы. Высвобожденный таким образом NFkB переносится в ядро и присоединяется к ДНК, что ведет к транскрипции гена.IкВ - ингибитор каппа В;
IкК - IкВ-киназа;
IL - интерлейкин; IRAK - киназа, ассоциированная с рецептором IL-1;
NFkB - нуклеарный фактор каппа В;
NOD - нуклеотидсвязывающий олигомерный домен;
Р - фосфорилирование;
TLR - Toll-подобные рецепторы;
TNF - фактор некроза опухоли;
TRAF6 - ассоциированный с TNF фактор 6;
дцРНК - двухцепочечная РНК;
ЛПС - липополисахариды.
Гомологи Toll дрозофилы у млекопитающих получили название Toll-подобные рецепторы. У человека одним из первых был идентифицирован TLR4. TLR стимулируют активацию сигнального пути NF-kB с экспрессией различных цитокинов и костимулирующих молекул, что является решающим фактором для формирования адаптивного иммунного ответа. В связи с этим сделано предположение о функционировании TLR в качестве рецепторов врожденной иммунной системы. Сейчас в семействе Toll-подобных рецепторов у человека известно около 23 членов (TLR-TLR23), однако не все они являются достаточно хорошо охарактеризованными. У мыши не выявлен TLR10, но обнаружен TLR11. Мыши, дефектные по TLR11 гену чувствительны к уропатогенным инфекциям.
Трансмембранные Toll-подобные рецепторы характеризуются внеклеточным NH-концом и внутриклеточным СООН-концом. TIR домен (Toll/IL-1 гомологичный домен) TLR, состоящий из 200 аминокислот и содержащий три высококонсервативных участка, опосредует взаимодействие между Toll-подобными рецепторами и молекулами, осуществляющими трансдукцию сигнала.
Toll-подобные рецепторы экспрессируются на клетках, осуществляющих первую линию защиты - нейтрофилах, макрофагах, ДК, эндоте-лиальных и эпителиальных клетках слизистых тканей. Недавно выявлено, что NK-клетки человека экспонируют следующие рецепторы: TLR3, TLR7, и TLR8. TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 и TLR11 располагаются на поверхности клетки. TLR7, TLR8 и TLR9, распознающие структуры, подобные нуклеиновым кислотам, локализуются внутриклеточно.
TLR1 (ген локализован на 4р14 хромосоме) высоко экспрессирован на клетках селезенки и клетках периферической . Предполагается, что TLR1-рецепторы функционируют в качестве корецепторов, однако прямые лиганды рецептора не выявлены и точная функция остается до конца неясной. Показано, что в комплексе с TLR2 рецепторами они участвуют в ответе на триацилированные липопротеины.
TLR2 (4q 31/3-32) играют ключевую роль в реагировании на продукты грамположительных бактерий, микобактерий, дрожжей. Широкий спектр распознаваемых паттернов TLR2 (пептидогликанов, липопротеинов и липотейхоевых кислот клеточной стенки) связан с возможностью образования данными рецепторами гетеродимеров с другими TLR. TLR2 образуют димеры с TLR6 и участвуют в распознавании пептидогликанов и диацилированных липопептидов грамположительных бактерий и микоплазм. Димеризуясь с TLR1, рецептор распознает триацилированные липопротеины, такие как Borrelia burgdorferi OspA.
TLR3 (4q35) распознают двухцепочечную РНК, молекулярные структуры вирусов, но не проводят сигнал от одноцепочечной РНК или двухцепочечной ДНК. У мышей, дефицитных по TLR3, наблюдается снижение ответа на полиинозин-полицитидин (синтетический аналог двухцепочечной РНК), в то время как чувствительность клеток, экспрессирующих TLR3, на него сохраняется.
Среди всех TLR наиболее изучен TLR4 (9q32-33). Он экспрессируется в организме на поверхности макрофагов, нейтрофилов, ДК, Т-, В-лимфоцитов и других. Напротив, у мышей, нокаутированных по TLR2 гену, ответ на ЛПС сохраняется. В TLR-опосредованном распознавании участвует еще белок MD2, а распознавание ЛПС осуществляется комплексом, состоящим из нескольких компонентов: CD14, TLR4, MD2. TLR4 и MD2 находятся в связанном состоянии, a CD14 вовлекается в комплекс после связывания ЛПС.