Сахарный бульон и сахарный агар
готовят путем прибавления к обычному бульону или расплавленному простому агару того или иного углевода в количестве от 0,5 до 1%. Углевод растворяют в небольшом количестве воды, а затем прибавляют к питательной среде. Стерилизацию сахарного бульона и агара производят в аппарате Коха 3 дня подряд по 1 часу.
Агар с кровью, сывороткой или с асцитической жидкостью
готовят при соблюдении строгой асептики. К готовому слабо-щелочному расплавленному и вновь охлажденному до 45° агару, разлитому в пробирки или флаконы, прибавляют 20-25% стерильной сыворотки или асцитической жидкости или 5-25% стерильной дефибринированной крови. После тщательного перемешивания (избегать образования пузырей и пены) агар в пробирках скашивают, а содержимое флаконов разливают по чашкам Гейденрейха. Бульон с сывороткой, асцитической жидкостью или кровью
готовят таким же способом, как агар, но без нагревания. Для контроля стерильности бульон ставят в термостат на 48 часов при 37°.
Дифференциально-диагностические питательные среды. Состав и назначение.
Среда Эндо. Готовится непосредственно перед употреблением. К 100 мл мясо-пептонного агара или агара на бульоне Хоттингера (pH 7,6) стерильно добавляют 1 г химически чистой лактозы, растворенной в 5 мл стерильной воды, охлаждают до 70° и добавляют смесь 0,5 мл насыщенного раствора основного фуксина и 1,25 мл свежеприготовленного 10% раствора сернистокислого натрия, взбалтывают и разливают по чашкам. Для подсушивания открытые чашки помещают на 30 минут в термостат при 37°.
На среде Эндо кишечная палочка дает колонии красного цвета с металлическим оттенком, а бактерии тифозно-паратифозной и дизентерийной группы - бесцветные колонии.
Пестрый ряд углеводов (среда Гисса). К 100 мл воды прибавляют 1 г пептона, 0,5 г поваренной соли. Пептон и соль растворяют в горячей воде в течение нескольких минут и фильтруют через бумажный фильтр (раствор должен быть совершенно прозрачным). Устанавливают pH 7,0. В указанной среде растворяют 1% одного из применяемых углеводов, на дно пробирок опускают поплавки для улавливания газа (свидетельствующего о глубоком расщеплении сахаров) и прибавляют индикатор. В качестве индикатора употребляют:
а) лакмусовую настойку - 5 мл на 100 мл среды. В кислой среде лакмусовая настойка показывает покраснение, в щелочной - посинение;
б) азолитмин, который представляет собой очищенный препарат лакмуса, его калийную соль (на 1 л среды добавляют 0,25 г азолитмина);
в) бромтимол блау - на 1 л среды 1 мл 1,6% спиртового раствора индикатора (среда приобретает зеленый цвет, синеет при образовании щелочи, желтеет при образовании кислоты);
г) индикатор Андреде, который состоит из 1 г кислого фуксина, 400 мл дистиллированной воды и 64 мл нормального раствора едкого натра. К питательной среде добавляют 1% индикатора. Среда в пробирке должна приобрести соломенно-желтый цвет без розового оттенка. В кислой среде цвет среды меняется на красный.
Индикатор добавляют для того, чтобы определить изменения реакции питательной среды, происходящей под влиянием ферментации углеводов, т. е. для выявления биохимической активности микробов. Последнее имеет большое значение для микробиологической диагностики ряда инфекционных заболеваний (брюшной тиф, дизентерия, холера и др.). Среды с углеводами и индикатором разливают в стерильные пробирки и стерилизуют дробно при 100° в течение 3 дней.
Короткий пёстрый ряд. Изменение при росте E. coli, S. typhi.
Методы выделения чистых культур аэробов.
Метод Дригальского
Выделение чистой культуры анаэробов.
См. пракнавыки
Вирусологические методы. Назначение, принцип.
Вирусологический метод
Основные этапы:
1. Забор исследуемого материала.
2.Выбор по принципу цитотропизма и получение чувствительной тест-системы, определение ее жизнеспособности.
3. Заражение выбранной системы.
4.Индикация вируса на основании обнаружения его нуклеиновой кислоты, антигенов, гемагглютинина, ЦПД, включений.
5. Идентификация и титрование вируса проводится на основании:
а) определения антигенов вируса с помощью иммунологических реакций (РИФ, ИФА, РПГА, РСК, РН, ВИЭФ и др.); б) патогистологического исследования органов и тканей; в) ЦПД; г) клинических симптомов, биологических проб (кератоконьюнктивальная и др.).
Методы индикации вирусов
При заражении вирусами клеточных культур можно получать различные видимые проявления действия вируса:
1. Цитопатическое действие вируса на культуру клеток (ЦПД) – возникновение в ней видимых морфологических дегенеративных изменений;
2. Приобретение заражённой культурой клеток способностик гемадсорбции – к адсорбции эритроцитов на поверхности клеточного слоя;
3. Образование в заражённой клеточной культуре под плотным слоем специального агарового покрытия характерных бляшек , являющихся «негативными колониями» вирусов;
4. Внутриклеточные включения
Питательные среды - биологические препараты, используемые для выращивания микроорганизмов и изучения культуральных, биохимических, антигенных свойств, фаголизабельности и чувствительности к антибиотикам.
Питательные среды широко используют в лабораторной практике при диагностике инфекционных заболеваний, а также для контроля за стерильностью лекарственных средств. Для того чтобы микроорганизмы росли и развивались, питательные среды должны отвечать следующим требованиям.
1. Оптимальный состав. В их состав должны входить все необходимые компоненты, которые нужны для развития микробов: белки, витамины, углеводы, минеральные вещества.
2. Оптимальное значение pH. Большинство микроорганизмов развивается при pH 7,2…7,4.
3. Стерильность. Она необходима для того, чтобы избегать конкурентной борьбы между микробами.
4. Прозрачность. Для лучшего изучения характера микробных колоний.
5. Влажность. Питание и дыхание осуществляются путем осмоса и диффузии, поэтому питательные среды должны быть слегка влажными.
Классификация сред . Питательные среды подразделяют по следующим признакам.
1. По консистенции: а) плотные (твердые) - агара 1,2…2 % (мясопептонный агар); б) полужидкие - агара 0,2…0,3 % (полужидкий агар); в) жидкие - мясопептонный бульон.
Для придания средам плотной или полужидкой консистенции чаще всего используют агар-агар - полисахарид, выделяемый из морских водорослей. Агар способен образовывать в воде гель, плавящийся при 80…100 °С и затвердевающий при 37…40 °С. Устойчивость агара к разжижающему действию большинства микроорганизмов, а также способность образовывать прочные студни обусловили его широкое применение в бактериологии.
2. По происхождению: а) искусственные: животного (МПА, МПБ) и растительного происхождения (пивное сусло); б) естественные: животного (кровь, молоко) и растительного происхождения (кусочки картофеля).
3. По составу: а) белковые; б) безбелковые; в) минеральные.
4. По назначению: а) среды для культивирования (простые, специальные); б) среды для обогащения (для накопления микроорганизмов при их низкой концентрации в исходном материале); в) среды консервирующие для первичного посева и транспортировки патогенов; г) среды для идентификации (дифференциально-диагностические) - микробы одного вида образуют колонии, отличающиеся по внешнему виду от колоний других микроорганизмов.
Если материал слабо загрязнен посторонней микрофлорой, то для выделения культур применяют простые среды общего назначения (МПА), при обильной контаминации сапрофитами используют специальные среды: элективные (для отдельных видов) и дифференциально-диагностические (для облегчения идентификации).
Характеристики сред . Консервирующие транспортные среды (глицериновая смесь, фосфатный буфер, тиогликолевая среда для анаэробов и др.). Предупреждают отмирание патогенных микробов и подавляют рост сапрофитов.
Среды обогащения (селективный бульон, желчный бульон, среда Мюллера, Раппопорт, среда Кауфмана, щелочная пептонная вода). Применяют для накопления определенной группы бактерий за счет создания условий, оптимальных для одних видов и неблагоприятных для других. Наиболее часто используют различные красители и химические вещества - соли, желчные кислоты, теллурит калия, антибиотики, фуксин и т. д.
Элективные (селективные среды) . Обеспечивают более благоприятные условия для изолируемого микроба с одновременным подавлением сопутствующей микрофлоры. Например, среды Плоскирева и солевой агар применяют для первичного посева материала или для пересева с консервирующих сред или сред обогащения с целью получения чистой культуры.
Дифференциально-диагностические среды . Предназначены для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ.
Среды для выявления протеолитической, гемолитической способности микробов . Содержат в своем составе белковые вещества (кровь, молоко, желатин и др.).
Среды с индифферентными химическими веществами . Служат источником питания для одних видов микробов и не усваиваются другими видами (цитратный агар Симмонса).
Среды с углеводами (моносахариды, дисахариды, полисахариды), многоатомными спиртами (сорбит, маннит), гликозидами (салицин, инозит) для обнаружения соответствующих ферментов.
Среды для определения редуцирующей способности микробов . В своем составе содержат краски, обесцвечивающиеся при восстановлении (агар Омелянского с индигокармином), а также нитраты для определения денитрифицирующей способности микроорганизмов.
Сухие питательные среды . В бактериологических лабораториях используют в основном коммерческие сухие среды. Они представляют собой высушенные и измельченные до порошкообразного состояния готовые питательные среды. У сухих сред имеется ряд преимуществ перед средами обычного изготовления: их можно хранить длительно в сухом затемненном помещении в герметически закрытой таре, они транспортабельны, удобны в применении и стандартны, что облегчает получение сравнимых результатов при бактериологическом исследовании.
Плотные среды состоят из питательной основы, агар-агара, индикаторов и других органических и минеральных веществ, улучшающих рост одних и задерживающих рост других микроорганизмов.
В качестве питательной основы сухих сред используют различные источники белка. За рубежом сухие среды чаще всего изготавливают на мясопептонном бульоне, требующем большого расхода говяжьего мяса. В нашей стране в качестве источника белка используют гидролизаты кильки, казеина, кормовых дрожжей.
Для упаковки сухих питательных сред используют стеклянные банки из оранжевого стекла (250 г), полиэтиленовые банки (250, 500, 1000 г), а также пакеты из трехслойной ламинированной бумаги (50…200 г). Сроки хранения в стеклянных и полиэтиленовых банках составляют 2…4 года, а в пакетах из трехслойного ламината - от 1 года до 4 лет.
Отечественная промышленность выпускает более 120 наименований различных сухих питательных сред. Крупнейшими производителями являются ФГУП НПО «Питательные среды» (г. Махачкала) и ГНЦПМ (г. Оболенск) (Меджидов М. М. Справочник по микробиологическим питательным средам. - М.: Медицина, 2003). Наиболее часто применяют в практических лабораториях следующие среды.
Сухие дифференциально-диагностические среды . Если раньше в практике ветеринарных бактериологических лабораторий для идентификации микроорганизмов широко использовались среды Гисса, содержащие какой-либо одни углевод, то в последнее время все шире стали применяться среды, позволяющие дифференцировать микроорганизмы по двум-трем признакам.
Среда Росселя (ФГУП НПО «Питательные среды»). Предназначена для первичной идентификации энтеробактерий. Готовая среда имеет зеленый цвет. После посева культуры через 18…20 ч инкубации при 37 °С о ферментации лактозы судят по появлению желтой окраски в скошенной части агара, а о ферментации глюкозы - по желтой окраске столбика агара. О газообразовании заключают по появлению пузырьков, разрывам агара. Если микроорганизм не ферментирует глюкозу и лактозу, то среда остается зеленой или приобретает синий цвет.
Среда Клиглера (ФГУП НПО «Питательные среды», г. Махачкала и АООТ «Биомед» им. И. И. Мечникова, г. Москва). Предназначена для первичной идентификации энтеробактерий. Готовая среда имеет красный цвет. Скашивать необходимо так, чтобы остался столбик высотой 2.5…3 см. Посев производят сначала в толщу среды, а затем по скошенной поверхности. Через 18…20 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты. Если микроорганизм ферментирует лактозу, то скошенная часть агара приобретает желтый цвет. При сбраживании глюкозы среда желтеет в столбике. При газообразовании - появление пузырьков и разрывы агара. В случае образования сероводорода среда приобретает черный цвет. Продуцирование индола определяют при помощи специальных индикаторных бумажек.
Двухслойный железоглюкозолактозный агар с мочевиной . Среда Олькеницкого (ФГУП НПО «Питательные среды»). Эти среды позволяют идентифицировать бактерии по их способности ферментировать глюкозу и лактозу, образовывать сероводород и расщеплять мочевину. С подробной инструкцией о приготовлении, способе посева микроорганизмов и учете результатов можно ознакомиться в «Справочнике по микробиологическим питательным средам» М. М. Меджидова.
Сухие элективные питательные среды . Элективный солевой агар (СА) (ФГУП НПО «Питательные среды» и ФГУП «Аллерген», г. Ставрополь). Предназначен для выделения стафилококков из исследуемого материала. Может служить основой для приготовления желточно-солевого или молочно-солевого агара. При посеве материала на СА через 48 ч инкубации при 37 °С рост стафилококков в виде круглых колоний диаметром 2…4 мм.
Элективно-питательная среда для выделения пневмококка (пневмококк-агар) (ФГУП НПО «Питательные среды»). Предназначена для элективного выделения пневмококка из патологического материала (крови, мокроты, гноя). Готовая среда имеет коричневый цвет. Через 24…48 ч после посева материала и инкубации его при 36…38 °С в условиях «свечного сосуда» пневмококк образует на среде выпуклые колонии размером до 1 мм, хорошо отличимые от бледно-розовых колоний стафилококка.
Питательная среда для изоляции грибов рода Candida (кандида-агар) (ФГУП НПО «Питательные среды», г. Махачкала). Предназначена для выделения грибов рода Candida из инфицированного материала и объектов внешней среды. Среда не подлежит автоклавированию. Грибы рода Candida на этой среде через 22…24 ч инкубации при 37 °С образуют плотные выпуклые или плоские колонии сметанообразной консистенции с ровными или волнистыми краями размером 1…2 мм.
Среда подавляет рост сопутствующей бактериальной флоры (кишечной палочки, протея, стафилококка).
Селективный агар для выделения и предварительной идентификации энтеробактерий в моче (аналог агара Мак-Конки) (ФГУП НПО «Питательные среды»). Рекомендуется для выделения и предварительной идентификации энтеробактерий из мочи, а также может быть использован при бактериологическом исследовании пищевых продуктов, фекалий, сточных вод.
Готовая среда красно-коричневого цвета, прозрачная, с легкой опалесценцией. Через 16…20 ч инкубации посева при 37 °С лактозоотрицательные сальмонеллы образуют прозрачные бесцветные колонии, лактозоположительные эшерихии - колонии ярко-малинового цвета. Среда подавляет «роение» протеев, которые растут в виде бесцветных изолированных колоний в О-форме. Рост стафилококков полностью подавляется.
Питательные среды других групп . Гликолевая среда (ФГУП НПО «Питательные среды», г. Махачкала; ОАО «Биомед» им. И. И. Мечникова, г. Москва). Предназначена для контроля стерильности медицинских и биологических препаратов. Учет результатов проводят согласно инструкции «Испытание лекарственных средств на микробиологическую чистоту».
Питательные среды № 1 и 2 выпускают ФГУП НПО «Питательные среды» (г. Махачкала) и ФГУП «Аллерген» (г. Ставрополь).
Питательная среда для контроля микробной загрязненности сухая № 1 . Используют для определения общей обсемененности нестерильных лекарственных препаратов и пищевых продуктов.
Питательная среда для контроля микробной загрязненности (Сабуро-агар) № 2 . Рекомендуется для культивирования грибов, а также определения содержания грибов в нестерильных лекарственных средах и других объектах внешней среды.
Эритрит-агар и эритрит-бульон . Предназначен для выделения и культивирования бруцелл.
Питательная среда для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба .
Кетоглутаровый агар . Эффективен для изоляции и культивирования возбудителя туляремии.
Среда АГВ . Предложена для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам дискодиффузным методом.
Питательная среда для экспресс-определения антибиотикочувствительности условно-патогенных бактерий . Предложена для ускоренного определения антибиотикочувствительности грамотрицательных условно-патогенных микроорганизмов. Учет результатов можно проводить через 4…5 ч.
Ассортимент выпускаемых отечественной промышленностью сухих питательных сред постоянно расширяется. Приведено лишь небольшое количество тех, которые могут быть использованы в повседневной работе ветеринарных лабораторий. Кроме того, в настоящее время имеется возможность приобретать и импортные питательные среды. Коммерческие названия можно узнать, заказав соответствующие каталоги. Однако их внедрение и широкое использование в ветеринарных лабораториях РФ возможно лишь в отдаленной перспективе из-за довольно высокой стоимости. Кроме того, в этой главе не упомянуты готовые коммерческие питательные среды довольно хорошего качества производства НИЦФ (г. Санкт-Петербург). Они расфасованы во флаконы по 400 мл; срок хранения 1 год. Среды, безусловно, могут быть полезны при проведении бактериологических работ в полевых условиях.
Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .
При приготовлении питательных сред необходимо учитывать потребность культивируемых микроорганизмов в различных элементах питания. Существует различные классификации питательных сред.
Классификация питательных сред по составу:
1. Простые среды (МПБ, МПА, желатин, пептонная вода). Мясо-пептонный бульон (МПБ) является белковой основой всех сред.
Существует несколько способов приготовления МПБ:
а) на мясной воде с добавлением готового пептона;
б) на переварах продуктов гидролиза исходного сырья при помощи ферментов.
Мясо-пептонный агар (МПА) — получают путем добавления агар-агара (1,5-3%) к МПБ. Если МПА распределен по диагонали пробирки или флакона — это скошенный агар. Если среда распределена в пробирке вертикально высотой 5-7 см, это агар столбиком. МПА, застывший в чашках Петри в виде штастшки — пластинчатый агар. Если среда имеет вертикальный слой высотой 2-3 см, и диагональный слой такой же величины, это полускошенный агар.
2. Сложные среды готовятся на основе простых с определенными добавками (углеводы, кровь, желчь, яйца, сыворотка, молоко, соли, факторы роста и т.п.)
Классификация питательных сред по исходным компонентам:
1. Естественные питательные среды — это натуральный продукт животного или растительного происхождения.
Могут быть:
Растительные (исходные продукты — соя, горох, картофель, морковь и т.п.).
Животные (исходные продукты — мясо, рыба, яйца, молоко, животные ткани, желчь, сыворотка крови и т.п.).
Смешанные (МПА, среда Левенштейна - Йенсена и т.п.).
2. Искусственные среды содержат переработанные естественные продукты (мясную воду, перевар), вещества, полученные из этих продуктов (пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты) и различные добавки. Это самая большая и разнообразная по составу наиболее часто применяемая группа сред. Их готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ.
3. Синтетические среды (известного химического состава) состоят из химически чистых соединений в точно установленных концентрациях (с добавлением углеводов, солей, аминокислот, витаминов и т.п.). На основе этих сред, добавляя к ним естественные или искусственные среды, получают полусинтетические среды.
Классификация питательных сред по консистенции: среды бывают жидкие (среды без агара), полужидкие (с агаром до 1%), плотные (агаровые — 1,5-2,5%). Жидкие среды чаще применяют для изучения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы и продуктов обмена. Полужидкие среды обычно используют для хранения культур, плотные — для выделения микроорганизмов, изучения морфологии колоний, диагностических целей, количественного учета, определения антагонистических свойств и др.
Классификация питательных сред по целевому назначению: универсальные (общеупотребительные) и специальные.
Универсальные (основные) среды. Эти среды используют для культивирования большинства относительно неприхотливых микроорганизмов или применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходимые для размножения того или иного вида микроорганизмов. К этой группе относятся: МПБ — мясо-пептонный бульон, МПА — мясо-пептонный агар, МПЖ — мясо-пептонный желатин и т.п.
Специальные среды. Предназначены для выделения и избирательного культивирования определенных видов микроорганизмов, которые не растут на простых средах.
Различают следующие виды специальных сред: среды обогащения, элективные, дифференциально-диагностические, консервирующие и среды накопления.
Среды обогащения. Многие микроорганизмы не растут на обычных средах, поэтому для повышения питательной ценности среды в нее добавляют углеводы (сахарный бульон или агар) или белки (сывороточный агар и бульон, кровяной агар и бульон). Кровяной агар или кровяной бульон — получают путем добавления к питательной среде 5-10% подогретой стерильной дефибринированной крови барана, кролика, лошади, человека. Среда используется для выделения стрептококков, пневмококков и других бактерий, а также для изучения гемолитической активности. Сывороточный бульон или сывороточный агар получают, путем добавления к простым средам 15-20% лошадиной или бычьей сыворотки.
2. Элективные (избирательные) среды. Эти среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида из материала, содержащего несколько видов микробов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микроорганизмов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого данная среда будет элективной. Избирательность среды достигается путем создания условий, оптимальных для культивирования определенных микробов (рН, Еh, концентрация солей, состав питательных веществ), т.е. положительной селекцией. Или путем добавления в среду веществ, угнетающих другие микроорганизмы (желчь, высокие концентрации NаС1, антибиотики и др.), т.е. отрицательной селекцией. К этой группе относятся:
Селенитовая среда — является лучшей средой обогащения для сальмонелл и дизентерийных микробов Зонне. Селенит натрия, содержащийся в среде, стимулирует рост этих бактерий и подавляет рост сопутствующей флоры.
Висмут-сульфит агар — содержит соли висмута, бриллиантовую зелень. Сальмонеллы растут на этой среде в виде колоний черного цвета. Другие виды бактерий на этой среде роста не дают.
Желточно-солевой агар (ЖСА) — среда для выделения стафилококков, содержит до 10% хлорида натрия, что подавляет большинство бактерий, содержащихся в материале. Кроме того, эта среда является и дифференциально-диагностической, так как присутствие яичного желтка позволяет выявить фермент лецитиназу (лецитовителлазу), который образуют патогенные стафилококки. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфорхолины и нерастворимые в воде жирные кислоты, поэтому среда вокруг лецитиназоположительных колоний мутнеет и появляется опалесцирующая зона в виде «радужного венчика».
Желчный бульон элективен для сальмонелл, размножение которых стимулирует добавленная 10% желчь, одновременно тормозящая рост сопутствующих микроорганизмов.
Щелочной агар или щелочная пептонная вода элективны для холерных вибрионов, щелочная реакция среды (рН 9,0) не препятствует росту холерных вибрионов, но тормозит рост других микроорганизмов. 3-5 сут. Ж
3. Дифференциально-диагностические среды. Дифференциально-диагностические среды применяют для дифференцировки одного вида микроорганизмов от другого по характеру их ферментативной активности. Состав этих сред подбирают с таким расчетом, чтобы четко выявить наиболее характерные свойства определенного вида микроорганизмов, основываясь на особенностях его обмена веществ.
Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе белковые вещества: кровь, молоко, желатин и т.п. Наиболее распространенными средами являются мясо-пептонный желатин (МПЖ) свернувшаясялошадиная сыворотка, молоко и кровяной агар (КА).
Среды для изучения гликолитических свойств включают три основных компонента: питательная основа (бульон, агар), субстрат (моно- и дисахара, многоатомные спирты) и индикатор для выявления соответствующих ферментов. Ферментативное расщепление субстратов приводит к сдвигу рН и изменению окраски среды. Наиболее распространены цветные среды с различными углеводами (например, с бромтимоловым синим, индикатором ВР). Также широко распространены среды Гисса, на которых учитывают различия в способности ферментировать различные углеводы с образованием кислоты, либо кислоты и газа.
Для дифференцировки энтеробактерий применяют пептонную воду с набором различных углеводов, индикатором Андреде и поплавками, облегчающими обнаружение газообразования и помогающие визуально определить изменение рН, характерное для различных микроорганизмов. В частности, сдвиг в кислую сторону вызывает покраснение среды с реактивом Андреде или пожелтение при использовании среды с бромтимоловым синим, тогда как при защелачивании индикатор Андреде и бромтимоловый синий не меняют цвет среды. Например, для выделения патогенных бактерий из кишечника применяют среды, которые позволяют дифференцировать патогенные микроорганизмы от постоянных обитателей кишечника — микроорганизмов, разлагающих лактозу.
Такой средой является среда Эндо. Основными компонентами среды Эндо являются МПА, лактоза и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия. Исходная питательная среда окрашена в светло-розовый цвет. При сбраживании лактозы образуется ацетальдегид, который реагирует с сульфитом и, высвободившийся при этом, фуксин окрашивает колонии в ярко-красный цвет. Поэтому кишечная палочка, которая сбраживает лактозу, при росте на этой среде образует красные колонии с металлическим блеском, а сальмонеллы и шигеллы — бесцветные, так как они не сбраживают лактозу .
4. Среды накопления, на которых происходит быстрый рост определенных видов микроорганизмов.
5. Консервирующие (транспортные) среды. Предназначены для сохранения микроорганизмов во время транспортировки к месту исследования. Эти среды, содержат добавки, предупреждающие размножение и гибель микробов, что способствует сохранению их жизнеспособности. Наибольшее применение нашли глицериновая смесь (среда Тига), фосфатно-буферная смесь и среды Кари-Блэйра, Амиеса (с активированным углем и без активированного угля), Стюарта и др.
Стерилизация питательных сред.
Все питательные среды независимо от их назначения разливают в чистую посуду и стерилизуют. Большинство сред стерилизуют автоклавированием, но при различных режимах в зависимости от их состава.
1. Синтетические среды и все агаровые среды, не содержащие в своем составе нативного белка и углеводов, стерилизуют 15-20 мин в автоклаве при температуре 115-120°С и давлении 1-1,5 атмосферы .
2. Среды с углеводами и молоком (в состав которого входит лактоза), питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 112°С и при давлении до 1 атмосферы.
3. Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыворотка крови, асцитическая жидкость), обеспложиваются тиндализацией или фильтрованием.
4. Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией через мембранные фильтры Зейтца.
Для контроля стерильности среды после стерилизации помещают в термостат при 37°С на 3-5 сут. Жидкие среды должны оставаться прозрачными, а на поверхности и в толще плотных питательных сред не должны появляться признаки роста. Кроме контроля стерильности, про-изводят химический контроль готовых сред, который заключается в том, что в нескольких об-разцах каждой серии определяют рН, количество общего и аминного азота и хлоридов.
Существует также биологический контроль сред. В этом случае несколько образцов среды засевают лабораторной культурой того микроба, для которого приготовлена среда, и изучают характер его роста. Только после того, как среды выдержали контроль, их можно использовать по назначению.
Питательные среды в микробиологии - это субстраты, на которых выращивают микроорганизмы и тканевые культуры. Они применяются для диагностических задач, выделения и изучения чистых культур микроорганизмов, получения вакцин и лекарств, для других биологических, фармацевтических и медицинских целей.
Классификация микробиологических питательных сред
В микробиологии питательные среды разделяют на:
- среды определенного и неопределенного состава;
- натуральные, полусинтетические и синтетические;
- основные, диагностические, элективные;
- плотные, полужидкие, жидкие, сухие, сыпучие.
Натуральными питательными средами называют те, что получают из природных материалов: крови, мяса, белков, органов животных, растительных экстрактов и растительного сырья. Примером таких сред могут быть мясной бульон, молочная сыворотка, пивное сусло, настои сена, агар-агар , кровь, желчь. Натуральные среды относятся к средам с неопределенным составом, который в разное время могут иметь разное количество тех или иных компонентов.
Полусинтетические среды тоже считаются средами с неопределенным составом. Они готовятся на основе натуральных питательных сред, но в них добавляются вещества, которые гарантируют культурам активное размножение. На полусинтетических средах выращивают культуры для получения витаминов, аминокислот, антибиотиков в промышленной фармацевтике.
Синтетические среды готовят из ингредиентов известного состава, в известной концентрации и соотношениях, поэтому эти среды относятся к средам определенного состава. С их помощью изучают метаболизм микроорганизмов, их биологические и физиологические свойства, возможность получения веществ, подавляющих или, наоборот, стимулирующих их развитие.
Основные, элективные и диагностические питательные среды
Основные среды служат для выращивания различных микробных культур, а также как основа для получения элективных и диагностических сред. К основным средам, например, относится мясной бульон, мясной агар, сусло, бульон Хоттингера. Для разных культур в основные среды добавляют некоторые компоненты для стимулирования роста - это могут быть витамины, аминокислоты, природные экстракты. Так, возбудитель коклюша выращивается на среде с добавлением крови.
Элективные среды - среды для избирательного (селективного) выращивания биологических культур. Состав среды подбирается так, чтобы быть оптимальным для одного вида или группы близкородственных бактерий и подавлять развитие бактерий других видов. Например, добавление в среду хлористого натрия 
в определенной концентрации подавляет рост всех бактерий, кроме стафилококков. С помощью элективных культур получают чистые культуры для дальнейшего размножения и накопления.
Диагностические среды служат для идентификации микроорганизмов. По изменению среды и ее химического состава (изменению окраски среды, появлению пузырьков газа и т.п.) определяют вид бактерий. В такие среды часто добавляют химические красители-индикаторы, такие как кристаллический фиолетовый , малахитовый зеленый, метиленовый синий , фусин и другие. Они помогают разделить близкие культуры. Скажем, в розовой среде Эндо, подкрашенной фусином, кишечная палочка образует колонии красного цвета, а тифозные и дизентерийные колонии бактерий - бесцветные.
Классификация питательных сред:
Натуральные – состоят из продуктов животного или растительного происхождения и имеют неопределенный химический состав. Например: овощные и фруктовые соки, животные ткани, кровь, молоко, яйца и т.д. (МПА, МПБ).
Полусинтетические – в состав входят соединения известной химической природы и вещества неопределенного состава. Например: МПБ с глюкозой, среда Эндо, среда Сабуро.
Синтетические – содержат только химически чистые соединения в точных концентрациях. Применяют в лабораторных экспериментах. Например: среда Чапека, Омелянского, Ушинского и т.д.
Назначение питательных сред
Универсальные (общего назначения)- пригодны для выращивания многих видов микроорганизмов и применяются как основа для специальных питательных сред. Примеры: МПБ, МПА, среда Хоттингера, ГРМ, тиогликолевая среда.
Специальные применяют в тех случаях, когда микроорганизмы не растут на простых средах. К ним принадлежит кровяной, сывороточный агар, сывороточный бульон, асцитический бульон, асцит-агар и другие.
1. Элективные среды - на них одни микроорганизмы растут быстрее и более интенсивно, чем другие виды бактерий. Например, 1 % щелочная пептонная вода является элективной средой для холерных вибрионов, среды Ру и Леффлера – для возбудителей дифтерии.
2. Селективные - благодаря селективным добавкам (желчь, краски, антибиотики и др.) способны подавлять развитие одних видов микроорганизмов, но не влияют на другие виды. Примеры: среда Мюллера является селективной для тифо-паратифозных бактерий, фуразолидоно-твиновий агар – для коринебактерий и микрококков. Добавление антибиотиков в состав сред делает их селективными для грибов (напр. среда Сабуро и др.).
3. Дифференциально-диагностические - группа сред, которые позволяют определить биохимические свойства микроорганизмов и провести их дифференциацию. Они разделяются на среды для определения протеолитических, пептолитических, сахаролитических, гемолитических, липолитических, редуцирующих свойств (среды Эндо, Левина, Плоскирева, Гисса).
4. Консервирующие (траспортные)-
предназначены для сохранения жизнеспособности микроорганизмов от момента взятия
биоматериала до посева для диагностики
Жидкие (бульоны) – изучение физиолого-биохимических особенностей и накопление биомассы микроорганизмов
Полужидкие (1% агара) – хранение культур и культивирование анаэробов
Плотные (3-5% агара)– выделение чистых культур, накопление, количественный учет, изучение культуральных свойств, антагонистические взаимоотношения
Сыпучие – хранение посевного материала в промышленности (пшено, отруби)
Сухие – выпускаются промышленностью для приготовления питательных сред
Транспортная система со средой Стюарта
Среда Стюарта представляет собой полужидкий, бедный питательными веществами субстрат для сохранения и транспортировки широкого спектра патогенных микроорганизмов, таких, как Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Corynebacterium diphteriae, Trichomonas vaginalis, Streptococcus sp., Salmonella sp., Shigella sp. и др. Наиболее требовательные микроорганизмы сохраняются в данной среде более суток, прочие – до нескольких дней.
Наличие в среде тиогликолата подавляет ферментативную активность бактерий, а отсутствие азота предотвращает их размножение.
Транспортная система со средой Кери Блэйр
Транспортная среда Кери Блейр представляет собой модификацию базовой транспортной среды Стюарта, предназначенную специально для фекальных образцов.
Глицерофосфат, являющийся метаболитом некоторых энтеробактерий (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, и др.), заменен неорганическим фосфатом,
удален метиленовый синий и рН среды увеличена до 8,4.
Среда Кери Блейр позволяет сохранять большинство патогенов, включая требовательные микроорганизмы, такие как Neisseria sp., Haemophilus sp., Streptococcus sp .
Данная среда является стандартной для транспортировки анаэробов.
Транспортная система со средой Эймса
Транспортная среда Эймса представляет собой очередную модификацию базовой транспортной среды Стюарта, в которой глицерофосфат заменен неорганическим фосфатом, поскольку глицерофосфат является метаболитом некоторых энтеробактерий (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, ets .) и может поддерживать рост некоторых грамотрицательных микроорганизмов.
Метиленовый синий заменен на активированный уголь фармацевтического качества.
В среду добавлены кальций и магний для поддержания проницаемости бактериальных клеток.
Эта среда способна более 3 дней поддерживать такие микроорганизмы, как Neisseria sp., Haemophilus sp., Corynebacteria, Streptococci, Enterobacteriaceae и др., однако наилучшие результаты дает культивирование в течение первых 24 часов.
Универсальные накопительные среды: Мясопептонный агар (МПА) и мясопептонный бульон (МПБ)
Являются основными средами для посевов микроорганизмов, для проверки чистоты культур перед биохимическим и серотипированием.
Их используют для культивирования и подсчета неприхотливых микроорганизмов. В полужидком виде среда может быть использована для хранения контрольных (эталонных) микроорганизмов.
Универсальные накопительные среды Среда Хоттингера
Предназначен для культивирования различных микроорганизмов, таких как энтеробактерии, синегнойная палочка, стафилококки, некоторые виды стрептококков. При необходимости может быть обогащен углеводами, солями.
Содержит гидролизат Хоттингера, который получают путём ферментативного гидролиза мясного фарша (говяжьего) панкреатином с последующим фильтрованием и добавлением хлороформа в качестве консерванта.
Универсальные накопительные среды: Среда Мюллера-Хинтона
Эту среду используют для культивирования Neisseria sp. и для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным средствам.
Среда МакКонки
Среды МакКонки в качестве дифференциальных рекомендуют для селективного выделения энтеробактерий и близких к ним грамотрицательных палочек.
Лактозоположительные штаммы растут с образованием розовых или красных колоний, которые могут быть окружены зоной преципитации желчных солей.
Красный цвет появляется в результате закисления среды продуктами разложения лактозы (при падении рН ниже 6,8) и адсорбции нейтрального красного.
Штаммы, не ферментирующие лактозу (шигеллы, сальмонеллы), обычно образуют прозрачные бесцветные колонии и не изменяют среду.
Дифференциально-диагностические среды: Среда Эндо
Эта среда разработана Endo как культуральная среда для дифференциации микроорганизмов, ферментирующих и неферментирующих лактозу. Она используется для микробиологического исследования воды, стоков, молочных и других пищевых продуктов.
Сульфит натрия и основной фуксин обладают подавляющим эффектом на грамположительные микроорганизмы. Лактоза разлагается микроорганизмами до альдегида и кислоты. Альдегид в свою очередь освобождает фуксин из фуксин-сульфитного комплекса, усиливая красное окрашивание колоний. У кишечных палочек эта реакция очень выражена и сопровождается кристаллизацией фуксина, что проявляется зеленоватым металлическим блеском (фуксиновый глянец) колоний.
Дифференциально-диагностические среды: Желточно-солевой агар
Эту среду используют в качестве селективной для выделения клинически значимых культур стафилококков.
Маннит является ферментируемым и дифференцирующим субстратом, а также источником углерода.
Добавление (до 5% об/об) эмульсии яичного желтка дает возможность определить липазную активность микроорганизмов. Эмульсия в солевой среде становится прозрачной, поэтому при наличии липазной активности вокруг колоний формируется желтая непрозрачная зона.
Дифференциально-диагностические среды: Вильсона-Блера или Висмут-сульфитный агар
Селективная среда для выделения сальмонелл.
Пептический перевар животной ткани и мясной экстракт служат источником азотистых питательных веществ, углерода, серы, витаминов группы В и микроэлементов, необходимых для роста указанных бактерий.
Бриллиантовый зеленый подавляет рост всех грамположительных бактерий. Глюкоза является ферментируемым углеводом. Сульфат железа позволяет выявить продукцию сероводорода.
Висмут является тяжелым металлом, который подавляет рост большинства грамотрицательных кишечных бактерий, кроме сальмонелл.
Сальмонеллы восстанавливают сульфат железа в присутствии глюкозы и сульфита висмута до сульфида железа, который окрашивает их колонии в черный цвет.
Специальные элективные среды: Среда Леффлера
Эту среду с добавлением лошадиной сыворотки используют для культивирования Corynebacterium diphtheriae из клинического материала и пересевов чистых культур этих микроорганизмов.
Высокая концентрация сыворотки помогает определить протеолитическую активность микроорганизмов, а также пигментообразование. Пептон и мясной экстракт обеспечивают микроорганизмы важнейшими питательными веществами. Глюкоза является ферментируемым субстратом и источником энергии.
Специальные селективные среды: Кампилобакагар
Селективная среду для кампилобактерий которая состояла из основы кровяного агара с бараньей кровью или лошадиной кровью и антибиотиками.
Антимикробные компоненты, существенно подавляют рост нормальной микрофлоры, способствуя росту и выделению из испражнений Campylobacter fetus ssp. jejuni .
Присутствие амфотерицина В в добавке существенно или полностью подавляет рост грибов, введенный позже цефалотин усиливает подавление нормальной кишечной микрофлоры.
Колонии Campylobacter fetus ssp. jejuni имеют слизистый характер, плоские серые с неправильными очертаниями или приподнятые, округлые, без гемолиза.
Некоторые штаммы могут образовывать желто-коричневые или розоватые колонии.
На влажной поверхности среды может наблюдаться слияние роста или роение
Загрузка...
