Создание биообъектов методами генетической инженерии. Основные принципы технологии рекомбинантной ДНК. Плазмиды. Транспозоны. Функции. Использование в конструировании продуцентов. Генетическая инженерия – один из важнейших методов биотехнологии, предполагающий целенаправленное искусственное создание определенных комбинаций генетического материала, способных нормально функционировать в клетке, т.е. размножаться и контролировать синтез конечных продуктов. Таким образом, генетическая инженерия включает выделение из клеток отдельных генов или синтез генов вне клеток, направленную перестройку, копирование и размножение выделенных или синтезированных генов, а также их перенос и включение в подлежащий изменению геном и таким путем можно добиться включения в клетки бактерий «чужых» генов и синтеза бактериями важных для человека соединений. Развитие генетической инженерии стало возможным благодаря открытию двух ферментов: рестриктаз, разрезающих молекулу ДНК в строго определенных участках и лигаз, сшивающих определенные участки различных молекул ДНК друг с другом. Кроме того, в основе генетической инженерии лежит открытие векторов, которые представляют собой короткие, самостоятельно размножающиеся в клетках бактерий кольцевые молекулы ДНК. С помощью рестриктаз и лигаз в векторы встраивают необходимый ген, добиваясь в последствии его включения в геном клетки-хозяина. Различают следующие виды генетической инженерии: Генная инженерия: её сущность состоит в целенаправленном использовании перестроек естественного генома, осуществляемых in vivo и in vitro, для изменения генетических характеристик известных вирусов и клеток, прямое манипулирование рДНК, включающими отдельные гены. Геномная инженерия: её сущность заключается в целенаправленной глубокой перестройке генома акариот, прокариот и эукариот, вплоть до создания новых видов, т.е. перенос всего или большей части генетического материала от одной клетки к другой. При геномной инженерии возможно получение половых (слиянием гамет) и соматических (слиянием неполовых клеток) гибридов. Хромосомная инженерия связана с переносом изолированных хромосом от клетки-донора одного организма в клетку-реципиент другого организма. Техника клеточной генной инженерии 1-ый метод. Метод перегруппировки генов Внутри клетки есть определенный набор и последовательность генов. При протопластировании идет перегруппировка генов. Также происходит и активация молчащих генов. П-ой метод. Слияние или фузия генов. Прокариот сливают с эукариотом, образуется рекомбинант, содержащий кусок одного ДНК и другого ДНК. Ш-й метод: Трансформация. а) клетка с определенным набором генов в ДНК -> живой протопласт без перегруппировки генов -> протопласт гибрид-рекомбинант -> клетка т б) выделение изолированной ДНК в пробирке - вектор (это кусок изолированной ДНК, выделенный из другого микроорганизма (фаг, плазмида) Если есть клетка и изолированная ДНК с нужным геном (вектор) - вектор может быть в виде фага, плазмиды, вируса, космиды (плазмида+ фаг), то можно включить вектор в изолированный протопласт (т.е. провести трансформацию). При этом образуются «+» продуценты с новыми качествами, но в клетке существуют системы репарации (восстановления) молекулы ДНК и постепенно эти рекомбинанты возвращаются к исходному (дикому) типу. Репарацию преодолевают следующим образом: «+» варианты дополнительно обрабатывают мутагенами для преодоления действия системы репарации; иммобилизация клеток «+» вариантов. Для того, чтобы прошла трансформация, необходимо сделать клетку компетентной, т.е.увеличитъ ее проницаемость. Это достигается следующим образом: воздействовать на клетку ионами тяжелых металлов (цинк, кобальт, литий, магний) воздействовать на клетку ферментами (лизоцим, комплексный фермент виноградной улитки) быстрое замораживание и оттаивание. Компетентные клетки легче поглощают вектор, куски ДНК. У них обнажена цитоплазматическая мембрана, которая в некоторых местах выходит на поверхность, и в образующиеся в этих местах окошечки, легко проникает вектор в виде изолированной ДНК, а также в виде фага, вируса, космиды (космида- изолированная ДНК или плазмида+ фаг). При протопластировании и слиянии протопластов может происходить явление амплификации (увеличение) генов - при этом продукция целевого назначения (витаминов, гормонов, антибиотиков) увеличивается. Клетки с амплификацией генов есть «+» вариант.
Совершенствование биообъекта методами генной инженерии.
Отличие клеточной инженерии от генной инженерии в том, что в генной инженерии имеют дело с изолированными ДНК, с которыми работают in vitro.
Суть технологии: производят соединение фрагментов ДНК in vitro (в пробирке) с последующим введением изолированной ДНК в живую клетку. Чистая генная инженерия - это техника обмена изолированными фрагментами ДНК. Это происходит с помощью ферментов, которые относятся к эндонуклеазам (например, рестриктазы).
20.5. Совершенствование биообъектов как источников ЛС включает несколько направлений. Определите эти направления в соответствии с целевыми задачами.
Современный биообъект, используемый в биотехнологической промышленности, - это суперпродуцент, отличающийся от исходного природного штамма по нескольким показателям.
высокий выход целевого продукта
2) способность расти на относительно дешевых питательных средах
3) благоприятные реологические свойства биомассы, обеспечивающие относительно несложное выделение продукта
4) устойчивость к фагам
5) благоприятные экологические показатели процесса (низкое спорообразование, запах и т.д.)
Методы совершенствования биообъектов
Мутации . Изменение биообъекта, благоприятное для его использования в производстве, должно передаваться по наследству и, соответственно, вызываться мутацией. На биохимическом уровне мутация - изменение первичной структуры ДНК в конкретном ее участке, что, в конечном счете, приводит к изменению фенотипа биообъекта.
Долгое время понятие мутации относили только к хромосомам у прокариот и хромосомам (ядру) у эукариот. В настоящее время кроме хромосомных мутаций появилось также понятие мутаций цитоплазматических (плазмидных - у прокариот, митохондриальных и плазмидных - у эукариот).
Спонтанные мутации встречаются, как правило, довольно редко. Разброс по степени выраженности признаков обычно невелик. Совершенствование биообъектов путем предварительного мутагенеза и последующей селекции оказалось гораздо более действенным.
Мутагенез осуществляется при обработке биообъекта физическими или химическими мутагенами. В первом случае, как правило, это ультрафиолетовые, гамма-, рентгеновские лучи; во втором - нитрозометилмочевина, нитрозогуанидин, акридиновые красители, некоторые природные вещества (например, из ДНК-тропных антибиотиков вследствие их токсичности не применяемых в клинике инфекционных заболеваний).
Механизма активности как физических, так и химических мутагенов связан с их непосредственным действием на ДНК (прежде всего на азотистые основания ДНК, что выражается в сшивках, димеризации, алкилировании последних, интеркаляции между ними).
Подразумевается, естественно, что повреждения не приводят к летальному исходу. Последующей задачей является отбор и оценка именно нужных биотехнологу мутаций. Эта селекционная часть работы в целом весьма трудоемка.
В первую очередь биотехнолога интересуют мутантные культуры, обладающие повышенной способностью к образованию целевого продукта. Потенциальные возможности мутагенеза (с последующей селекцией) обусловлены зависимостью биосинтеза целевого продукта от многих метаболических процессов в организме продуцента. Весьма эффективный путь увеличения образования целевого продукта - нарушение системы ретроингибирования .
Повысить активность продуцента можно также, изменив (за счет мутаций) систему транспорта предшественников целевого продукта в клетку.
Наконец, иногда целевой продукт при резком увеличении его образования отрицательно влияет на жизнеспособность собственного продуцента (так называемый суицидный эффект). Повышение резистентности продуцента к образуемому им же веществу часто необходимо для получения, например, суперпродуцентов антибиотиков.
Одним из самых блестящих примеров эффективности мутагенеза с последующей селекцией по признаку увеличения образования целевого продукта является история создания современных суперпродуцентов пенициллина. Работа с исходными биообъектами - штаммами (штамм - клоновая культура, однородность которой по определенным признакам поддерживается отбором) гриба Penicillium chrysogenum, выделенными из природных источников, велась с 1940-х гг. в течение нескольких десятилетий во многих лабораториях. Вначале некоторый успех был достигнут при отборе мутантов, появившихся в результате спонтанных мутаций. Затем перешли к индуцированию мутаций физическими и химическими мутагенами. В результате ряда удачных мутаций и ступенчатого отбора все более продуктивных мутантов активность штаммов сейчас в 100 тыс. раз выше, чем у обнаруженного А.Флемингом исходного штамма, с которого и началась история открытия пенициллина.
Производственные штаммы крайне нестабильны вследствие того, что многочисленные искусственные изменения в геноме клеток штамма сами по себе для жизнеспособности этих клеток положительного значения не имеют. Поэтому мутантные штаммы требуют постоянного контроля при хранении:
Совершенствование биообъектов применительно к производству не исчерпывается только повышением их продуктивности. С экономической точки зрения весьма важно получение мутантов, способных использовать более дешевые и менее дефицитные питательные среды. Большое значение в отношении гарантии надежности производства приобретает получение фагоустойчивых биообъектов.
Из всего изложенного следует, что современный биообъект, используемый в биотехнологической промышленности, - это суперпродуцент, отличающийся от исходного природного штамма не по одному, а, как правило, по нескольким показателям. Хранение таких штаммов-суперпродуцентов представляет серьезную самостоятельную проблему.
В случае применения высших растений и животных в качестве биообъектов для получения лекарственных средств возможности использования мутагенеза и селекции для их совершенствования ограничены.
Совершенствование биообъектов методами клеточной инженерии
Клеточная инженерия - «насильственный» обмен участками хромосом у прокариот или участками и даже целыми хромосомами у эукариот. В результате создаются неприродные биообъекты, среди которых могут быть отобраны продуценты новых веществ или организмы с ценными в практическом отношении свойствами.
Перспективы клеточной инженерии заключаются прежде всего в том, что с ее помощью возможно получение межвидовых и межродовых гибридных культур микроорганизмов, а также гибридных клеток между отдаленными в эволюционном отношении многоклеточными организмами.
Первый этап работы связан с удалением у микроорганизмов клеточной стенки.
Пептидогликан клеточной стенки может быть расщеплен с помощью ферментов (гидролаз пептидогликана), из которых самым известным является лизоцим,
При протопластировании: для получения протопластов клеточную стенку удаляют ферментативной обработкой в «гипертонической» среде с 20 % раствором сахарозы или маннита, иногда с 10 % раствором натрия хлорида в зависимости от определенных особенностей биообъекта и преследуемых целей.
Если биообъект принадлежит к микроскопическим (плесневым и дрожжевым) грибам, то для получения протопластов используют, как правило, не лизоцим, а комплексный ферментный препарат, выделенный из пищеварительного тракта виноградной улитки. Связано это с тем, что состав клеточной стенки у грибов более сложен, чем у бактерий.
Следующий этап работы состоит в объединении суспензий двух образцов протопластов, принадлежащих разным штаммам или разным видам, в более редких случаях - даже разным родам. Частота слияния резко повышается при добавлении к протопластам полиэтиленгликоля, обладающего свойствами детергента.
Культуры таких клеток обладают новыми свойствами. В качестве примера можно привести получение «гибридных» антибиотиков.
Известно, что среди актиномицетов есть принадлежащие к разным видам продуценты антибиотиков гликозидной структуры с варьирующими агликонами и сахарами. Так, антибиотик эритромицин имеет 14-членный макроциклический агликон и два сахара (дезозамин и кладинозу), присоединенных к нему гликозидной связью, а у антибиотиков - антрациклинов агликон состоит из четырех сконденсированных углеродных шестичленных колец, соединенных с аминосахаром.
С помощью клеточной инженерии были получены продуценты таких антибиотиков, у которых макролидный агликон эритромицина был связан с углеводной частью, соответствующей антрациклинам, и наоборот, антрациклиновый агликон с сахарами,
свойственными эритромицину.
Создание биообъектов методами генетической инженерии
Генетическая инженерия гораздо конкретнее и точнее клеточной по характеристике используемых объектов и оперирует в основном с разными по форме и размерам фрагментами клетки.
Генетическая инженерия - соединение фрагментов ДНК природного и синтетического происхождения или их комбинацию с последующим введением полученных рекомбинантных структур в живую клетку для того, чтобы введенный фрагмент ДНК после включения его в
хромосому либо реплицировался, либо автономно экспрессировался.
Основные этапы генетической инженерии
1) Получение ДНК (химический синтез, из мРНК, обработка ДНК рестриктазой)
2) Линеаризация вектора для клонирования той же рестриктазой
3) Смешивание ДНК и разрезанного вектора
4) Трансформация сшитыми молекулами вектора клеток-хозяев
5) Амплификация рекомбинантной ДНК в трансформированных клетках
6) Получение белкового продукта
Антропогенное воздействие на биосферу неотъемлемо от развития цивилизации. Распашка земель, вырубка лесов, «вытаптывание» степей постоянно сопутствуют истории человечества. Уместно вспомнить об уничтожении отдельных видов животных и растений и о расселении некоторых видов из мест коренного обитания.
В связи с особой актуальностью проблемы влияния промышленности на биосферу рассмотрим, как выглядит в этом отношении биотехнологическое производство. Прежде всего, оно наукоемко и по сравнению с химико-технологическим производством более эффективно, так как клетка продуцента (биообъекта) представляет «сбалансированный комплекс биокатализаторов», работающий более производительно, чем системы последовательных химических реакций с неорганическими катализаторами.
Потребление энергоресурсов и воды биотехнологической промышленностью составляет доли процента от потребляемого современной химической промышленностью. Выброс в атмосферу газообразных отходов предприятий биотехнологической промышленности не превышает и десятой доли процента от выброса промышленностью в целом. Именно биотехнологическое производство наиболее приемлемо в современных условиях, однако и оно имеет специфические, экологические проблемы и, соответственно, совершенствуется в направлениях:
Создания и использования более активных биообъектов-продуцентов (в результате на единицу продукции будет меньше отходов!);
Замены сред и реагентов на менее дефицитные;
Иммобилизации биообъектов (как клеток, так и ферментов), многократного их использования для уменьшения отходов;
Внедрения мембранной технологии на стадии выделения и очистки целевого продукта (уменьшение количества применяемых органических растворителей во избежание агрессивных условий на некоторых стадиях производственного процесса);
Соблюдения правил GMP.
Рассмотрим кратко проблемы, относящиеся к ликвидации (утилизации) или очистки производственных отходов традиционного биотехнологического предприятия.
Твердые отходы. Прежде всего, к ним относится мицелий (биомасса) продуцента после его отделения от культуральной жидкости и целевого продукта. О количестве мицелия, с которым приходится иметь дело, можно получить наглядное представление исходя из того, что объем слива промышленного ферментера - это 50- 100 м 3 густой, вязкой (из-за наличия мицелия) жидкости. Учитывая, что на предприятии имеется ряд ферментеров, а ферментационный цикл длится около недели, можно сделать вывод, что этот вид твердых отходов на одном (крупном) предприятии составляет сотни тонн в год. При этом необходимо учитывать, что мицелий содержит и остаточные количества целевого продукта, а это, как правило, биологически высокоактивные вещества.
В настоящее время твердые отходы ликвидируют путем переработки мицелия. Его перемешивают с почвой и помещают в ямы с бетонными подложками. Каждую такую яму оставляют закрытой
на несколько лет. За это время почвенные микроорганизмы подвергают органические вещества мицелия ферментативному расщеплению, используя их для построения «своей» биомассы. Фактически образуется компост, органическая часть мицелия при этом разлагается. Бетонная подложка в такого рода «компостных ямах» необходима, чтобы предотвратить попадание еще неразложившихся растворимых органических веществ мицелия в грунтовые воды и водоемы с дождевой водой. Обычно для компостных ям выделяют специальные участки на территории предприятия. Отметим, что вывоз подсушенного мицелия (его масса по сравнению с первоначальной уменьшается в 10-100 раз) на общегородские свалки запрещен.
Попытки применения мицелия для тех или иных целей в целом пока не увенчались успехом, однако в лабораторных условиях уже создана малоотходная технология. Из мицелия актиномицета продуцента тетрациклина извлекалась суммарная липидная фракция и использовалась как пеногаситель в следующем производственном цикле при получении тетрациклина, образуемого продуцентом, принадлежащем к тому же штамму. В некоторых случаях (при ограниченности пастбищ) простерилизованную и перемолотую биомассу некоторых микроорганизмов используют в качестве добавки в корм сельскохозяйственных животных. Мицелий грибов и актиномицетов (отходы при производстве антибиотиков) повышает качество некоторых строительных материалов (керамзитовые плиты, кирпич и др.), увеличивая их прочность. Но по экономическим соображениям производить эти материалы нецелесообразно.
Жидкие отходы. В случае биотехнологического производства жидкими отходами являются стоки и сточная жидкость, в основном это культуральная жидкость после отделения от нее мицелия и извлечения целевого продукта. Суммарный годовой объем культуральной жидкости, которая должна подвергнуться очистке, составляет для одного предприятия десятки тысяч кубометров. Степень очистки, контролируемой разными методами, должна быть такой, чтобы очищенная жидкость могла сливаться в открытые водоемы.
Существуют разные схемы очистки. Почти во всех из них ключевую роль играют микроорганизмы (биологическая очистка). Приведем одну из таких схем. Первым компонентом системы очистки является железобетонный отстойник, куда попадает отработанная культуральная жидкость. На дне отстойника проложены трубы, через которые происходит отсасывание осадка. На этой стадии из культуральной жидкости удаляется примерно 40 % загрязнений.
Следующий участок системы очистки состоит из одного или нескольких, расположенных один за другим, аэротенков - баков с проходящими по дну трубами, из которых выходит в виде пузырьков воздух, проходящий через всю толщу жидкости, в результате она насыщается кислородом. Воздух способствует интенсивному протеканию окислительных процессов. Ключевая особенность аэротенка - наличие в нем так называемого «активного ила» (искусственного биоценоза - сообщества микроорганизмов, окисляющих растворенные в жидкости органические вещества до СО 2 и Н 2 О), постепенно формирующегося в процессе работы предприятия.
Видовой состав биоценоза активного ила на разных предприятиях может незначительно варьировать, поскольку последний зависит от окисляемых субстратов. Как правило, в нем доминируют представители рода Pseudomonas (70 %). Далее следуют микроорганизмы, объединенные в род Bacterium (20%). Остальные 10% составляют представители родов Bacillus, Sarcina и другие микроорганизмы. Характеризуя активный ил как биоценоз или как надорганизменное межвидовое сообщество применительно к очистке сточной жидкости биотехнологического производства, следует отметить три важных обстоятельства.
Во-первых, принципиальную роль здесь играют штаммы рода Pseudomonas. Однако не следует сводить этот род только к виду Pseudomonas acruginosa - известному возбудителю опасных раневых инфекций. В природных условиях род Pseudomonas представлен большим количеством не опасных для человека видов. Именно непатогенные штаммы входят в состав активного ила. Для этих микроорганизмов характерен широкий набор окислительных ферментов. Препараты, состоящие из клеток Pseudomonas, используются при ликвидации загрязнений, вызванных утечкой нефти. Окислению подвергаются, образно говоря, и экзотические субстраты, например, кольчатые углеводороды. Помимо этого оболочка сапрофитных видов Pseudomonas, входящих в активный ил, имеет свои особенности на уровне пориновых каналов, облегчающие доступ субстратов к окислительным ферментам.
Во-вторых, превращение некоторых субстратов в СО 2 и Н 2 О осуществляется за счет последовательного воздействия на них ферментов разных микроорганизмов. Иными словами, одна ферментная система превращает конкретное соединение в промежуточные продукты, а другая катализирует дальнейшую деградацию этих промежуточных продуктов. Этим подчеркивается, что активный ил функционирует как комплекс микроорганизмов.
В-третьих, следует иметь в виду, что в сточных водах некоторых производств (в частности, предприятий антибиотической промышленности) могут содержаться остаточные количества антимикробных веществ. Это означает, что микроорганизмы в аэротенках постоянно контактируют с ними, т.е. создаются условия для селекции резистентных форм. Но не исключены случаи, когда концентрация антимикробных веществ в очищаемых жидких отходах может оказаться необычно высокой и вызвать гибель клеток активного ила.
Это требует контроля за состоянием активного ила. После участка с аэротенком или несколькими последовательно расположенными аэротенками и вторичным отстойником принципиально важным для системы жидких отходов является «блок доочист-ки». В нем культуральная жидкость, в которой остается примерно 10 % первоначального содержания органических веществ (как правило, это трудноокисляемые вещества), пропускается через биофильтры - пленки с иммобилизованными клетками микроорганизмов с наиболее высокой окислительной активностью. Нередко эти клетки принадлежат к сконструированным методами генной инженерии штаммам, содержащим плазмиды, несущие гены окислительных ферментов (ферментов деструкции). Такие целенаправленно полученные «штаммы-деструкторы» способны окислять трудноокисляемые вещества и уничтожать оставшиеся 10% загрязнений в очищаемой жидкости.
Иммобилизация клеток таких штаммов в биопленках рациональна ввиду того, что при свободном размножении этих клеток искусственно повышенная окислительная активность может быть утрачена за счет обратных мутаций или потери плазмид. В этом случае в «блоке доочистки» как бы «сочетаются» генная инженерия и инженерная энзимология. Прошедшая «блок доочистки» жидкость, соответствующая официальным критериям питьевой воды (одним из принятых методов контроля токсичности в данном случае является подавление жизнеспособности микроскопического
ракообразного Daphnia magna), хлорируется и затем поступает в открытые водоемы.
Касаясь работы систем биологической очистки сточных вод в разных режимах, следует отметить, что при максимальных («шоковых») нагрузках могут возникнуть разные трудности. В такие рабочие периоды в аэротенки вносят высокоактивные штаммы деструкторы («бактериальные закваски»), что позволяет значительно усилить пропускную способность системы очистки жидких отходов. С этой целью для биотехнологических предприятий разного профиля рекомендованы специальные препараты: «Phenobac» - для утилизации углеводородов, «Thermobac» - для окисления полисахаридов, «Polibac» - для освобождения от синтетических детергентов и т. п. Ориентировочная доза «бактериальной закваски» из живых клеток составляет около 100 мг на 1 м 3 сточной жидкости.
В заключение отметим возможное разнообразие схем биологической утилизации жидких отходов. Так, помимо аэробной очистки в схему могут быть включены: этап анаэробной очистки, этапы с использованием сорбентов (активированного угля, цеолитов и др.), этапы с применением электрохимических методов (например, электрокоагуляции).
Газообразные отходы. Газовые выбросы очищают от органических соединений при температуре от 300 до 1 000 °С в колонках с неорганическими катализаторами. В этом случае летучая «органика» превращается в СО 2 . В некоторых случаях используются биологические фильтры на основе микроорганизмов, окисляющих органические вещества до СО 2 .
Суперпродуцент – это объект промышленного использования. Как можно получить его и какими свойствами должен он обладать в отличие от природного штамма?
Совершенствование биообъектов как источников ЛС включает несколько направлений. Определите эти направления в соответствии с целевыми задачами.
Современный биообъект, используемый в биотехнологической промышленности, - это биологический организм-суперпродуцент, отличающийся от исходного природного штамма по нескольким показателям.
1) безвредность для потребителя и обслуживающего персонала.
2) генетическая однородность и стабильность в отношении к субстратам и условиям культивирования.
3) высокий выход целевого продукта
4) способность расти на относительно дешевых питательных средах
5) благоприятные реологические свойства биомассы, обеспечивающие относительно несложное выделение продукта
6) устойчивость к фагам
7) благоприятные экологические показатели процесса (низкое спорообразование, запах и т.д.)
8) Отсутствие токсических веществ в целевом продукте и промышленных стоках.
Совершенствование биообъектов методами мутации и селекции
На биохимическом уровне мутация - изменение первичной структуры ДНК организма и, как следствие, изменение фенотипа биообъекта. Изменение биообъекта, благоприятное для его использования в производстве (мутация), должно передаваться по наследству.
Долгое время понятие мутации относили только к хромосомам у прокариот и хромосомам (ядру) у эукариот. В настоящее время кроме хромосомных мутаций появилось также понятие мутаций цитоплазматических (плазмидных - у прокариот, митохондриальных и плазмидных - у эукариот).
Спонтанные мутации встречаются, как правило, довольно редко. Совершенствование биообъектов путем мутаций и последующей селекции оказалось гораздо более действенным.
Мутагенез осуществляется при обработке биообъекта физическими или химическими мутагенами. В первом случае это ультрафиолетовые, гамма-, рентгеновские лучи; во втором - нитрозометилмочевина, нитрозогуанидин, акридиновые красители, антибиотики, специфично взаимодействующие с ДНК (их обычно не используют в терапии).
Механизм действия как физических, так и химических мутагенов связан с их непосредственным влиянием на ДНК (прежде всего на азотистые основания ДНК, что выражается в сшивках, димеризации, алкилировании последних, интеркаляции между ними). Повреждения не должны приводить к летальному исходу. Последующей задачей является отбор (селекция) нужных биотехнологу мутаций. Эта часть работы в целом весьма трудоемка.
В первую очередь биотехнолога интересуют мутантные культуры, обладающие повышенной способностью к образованию целевого продукта. Продуцент целевого вещества, наиболее перспективный в практическом отношении, может многократно обрабатываться разными мутагенами. Новые мутантные штаммы, получаемые в научных лабораториях разных стран мира, служат предметом обмена при творческом сотрудничестве, лицензионной продажи и т.п.
Одним из примеров эффективности мутагенеза с последующей селекцией по признаку увеличения образования целевого продукта является история создания современных суперпродуцентов пенициллина. Работа с исходными биообъектами - штаммами гриба Penicillium chrysogenum, выделенными из природных источников, велась с 1940-х гг. в течение нескольких десятилетий во многих лабораториях. Вначале проводили отбор в результате спонтанных мутаций. Затем перешли к индуцированию мутаций физическими и химическими мутагенами. В настоящее время активность штаммов сейчас в 100 тыс. раз выше, чем у обнаруженного А. Флемингом исходного штамма, с которого и началась история открытия пенициллина.
Производственные штаммы крайне нестабильны вследствие того, что многочисленные искусственные изменения в геноме клеток штамма сами по себе для жизнеспособности этих клеток положительного значения не имеют. Поэтому мутантные штаммы требуют постоянного контроля при хранении.
Совершенствование биообъектов не исчерпывается только повышением их продуктивности. С экономической точки зрения весьма важно получение мутантов, способных использовать более дешевые и менее дефицитные питательные среды. Большое значение в отношении гарантии надежности производства приобретает получение фагоустойчивых биообъектов.
Таким образом, современный биообъект, используемый в биотехнологическом производстве, - это суперпродуцент, отличающийся от исходного природного штамма не по одному, а, как правило, по нескольким показателям.
В случае применения высших растений и животных в качестве биообъектов для получения лекарственных средств возможности использования мутагенеза и селекции для их совершенствования ограничены.
Совершенствование биообъектов методами клеточной инженерии
Клеточная инженерия - «насильственный» обмен участками хромосом у прокариот или участками и даже целыми хромосомами у эукариот. В результате создаются неприродные биообъекты, среди которых могут быть отобраны продуценты новых веществ или организмы с ценными в практическом отношении свойствами.
С помощью клеточной инженерии возможно получение межвидовых и межродовых гибридных культур микроорганизмов, а также гибридных клеток между отдаленными в эволюционном отношении многоклеточными организмами. Культуры таких клеток обладают новыми свойствами. В качестве примера можно привести получение «гибридных» антибиотиков.
Известно, что среди актиномицетов есть принадлежащие к разным видам продуценты антибиотиков гликозидной структуры с варьирующими агликонами и сахарами. Так, антибиотик эритромицин имеет 14-членный макроциклический агликон и два сахара (дезозамин и кладинозу), присоединенных к нему гликозидной связью, а у антибиотиков - антрациклинов агликон состоит из четырех сконденсированных углеродных шестичленных колец, соединенных с аминосахаром.
С помощью клеточной инженерии были получены продуценты таких антибиотиков, у которых макролидный агликон эритромицина был связан с углеводной частью, соответствующей антрациклинам, и наоборот, антрациклиновый агликон с сахарами, свойственными эритромицину.
Создание биообъектов методами генетической инженерии
Генетическая инженерия – это методы получения рекомбинантных ДНК, объединяющих последовательности различного происхождения.
Гены, кодирующие белки человека, вводятся в геном одноклеточных (E. coli, Corynebacterium, Saccharomyces cerevisiae и др.). В результате микробные клетки синтезируют соединения, специфичные для человека - белковые гормоны, белковые факторы неспецифического иммунитета (инсулин, соматотропин, интерфероны, факторы свертывания крови, лактоферрин и т.д.)
Основные этапы генетической инженерии
1) Получение ДНК (химический синтез, из мРНК, обработка ДНК рестриктазой)
2) Линеаризация вектора для клонирования той же рестриктазой
3) Смешивание ДНК и разрезанного вектора
4) Трансформация сшитыми молекулами вектора клеток-хозяев
5) Размножение клеток-хозяев, амплификация рекомбинантной ДНК в трансформированных клетках
6) Получение белкового продукта
Таким образом, генетическая инженерия позволяет создавать биологически активные вещества человека вне его организма.
«Методы селекции животных и растений» - Селекция микроорганизмов. Патогенные микроорганизмы вызывают болезни растений, животных и человека. Биотехнология. Дальнейший прогресс человечества во многом связан с развитием биотехнологии. БИОТЕХНОЛОГИЯ, использование живых организмов и биологических процессов в промышленном производстве. Иногда к микроорганизмам относят вирусы.
«Вавилов основы селекции» - модульный блок «Селекция». Способ организации учебного процесса на основе блочно-модульного представления учебной информации. Структура урока. Комплексная дидактическая цель (КДЦ): Основы селекции. Модуль № 1. Работы Н.И.Вавилова.
«Селекция» - Применение ферментных препаратов в виноделии позволяет ускорить созревание и улучшить качество вин. Плесневые и лучистые грибы, измененные методами селекции, вырабатывают в сотни раз больше антибиотиков по сравнению с исходными формами. Селекция микроорганизмов. На разработку новых методов селекционной работы большое влияние оказала генетика - теоретическая база селекции.
«Основы селекции» - Родина кукурузы, какао, фасоли, красного перца. Восточноазиатский центр. Аутбридинг. Родина ананаса, картофеля, хинного дерева, томатов. Главные центры происхождения культурных растений. Селекция растений. Биотехнология. Средиземноморский центр. И. В. Мичурин разработал метод отдаленной гибридизации для получения новых сортов.
«Селекция микроорганизмов» - Родственное. Кто является родоначальником различных пород овец? Миекодром. Кошек 20. Страусов 18. Назовите породы коров, разводимых у нас в республике? Уток 15. Индивидуальный. Кто является родоначальником различных пород свиней? Прочитайте текст и укажите на ошибки. Назовите породы, разводимые у нас в республике?
«Биология селекция» - Методы селекции растений. СЕЛЕКЦИЯ – эволюция, управляемая человеком. Центры происхождения культурных растений. Воздействие радиацией и химическими веществами на растения и животных. Задачи селекции. Метод мутагенеза. Метод гибридизации. Закон гомологических рядов наследственной изменчивости. Название науки от латинского «селекцио» - выбор, отбор.
Загрузка...
